ERO1α慢病毒過表達載體的構建及其在RAW264.7細胞中穩定表達

戴安娜 胡佳慧 屈玉杏 劉婉洋 許顯玉

摘要[目的]構建小鼠ERO1α基因慢病毒過表達載體，并篩選其在RAW264.7細胞中穩定表達。[方法]利用PCR方法擴增ERO1α基因的CDS區并測序;將目的片段亞克隆到慢病毒過表達載體pCD513B-1上，構建pCD513B-ERO1α慢病毒過表達載體;通過病毒包裝產生慢病毒并轉導RAW264.7細胞;轉導后的細胞進行嘌呤霉素抗性篩選，獲得穩定表達的細胞;利用RT-qPCR和Western blot方法檢測ERO1α的表達效果。[結果]ERO1α慢病毒過表達載體構建成功，病毒滴度為5×106～10×106 TU/mL;慢病毒成功轉導RAW264.7細胞并且穩定高表達。[結論]成功構建ERO1α慢病毒過表達載體，并在RAW264.7細胞中穩定高表達，為進一步研究ERO1α在免疫系統中的功能提供了技術支持。

關鍵詞慢病毒;ERO1α;過表達;RAW264.7細胞

中圖分類號S-852文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2019）02-0089-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.02.026

內質網氧化還原酶1α（endoplasmic reticulum oxidoreductase 1α，ERO1α）是內質網中的重要氧化還原酶，屬于ERO1蛋白家族。在內質網蛋白質折疊過程中，ERO1α通過特異性識別蛋白質二硫鍵異構酶（protein disulfide isomerase，PDI）對分泌蛋白和膜蛋白二硫鍵形成起到至關重要的作用[1-3]。近年來，研究發現ERO1α在多種腫瘤細胞和癌癥中高表達，且過表達ERO1α有利于腫瘤的生長[4]。研究發現ERO1α通過上調血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達，激活腫瘤血管生成信號從而促進腫瘤的生長[5]。除此之外，ERO1α通過促進粒細胞集落刺激因子（granulocyte colonystimulating factor，G-CSF）、趨化因子[chemokine （C-X-C motif） ligand 1/2，CXCL1/2]和主要組織相容性復合體I（major histocompatibility complex，MHC class I）的表達，抑制機體的免疫應答從而使得腫瘤增強免疫耐受和逃逸[6-7]。雖然ERO1α在機體免疫方面的研究越來越多，但是對于相關分子機制的研究報道還是很少。筆者通過構建ERO1α慢病毒過表達載體并穩定轉導小鼠巨噬細胞系RAW 264.7細胞，以期為進一步研究ERO1α的免疫調節作用奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要細胞、載體和細菌。RAW264.7細胞、HEK293T細胞、慢病毒過表達載體（穿梭載體）pCD513B-1、慢病毒包裝輔助載體pGag/Pol、pRev和pVSV-G，均由西北農林科技大學靳亞平教授饋贈;pMD19-T載體，購自大連TaKaRa生物工程有限公司;大腸桿菌DH5α感受態細胞，購自北京天根生物技術有限公司。

1.1.2主要試劑。Total RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、PrimeSTARTM HS DNA Polymerase、PrimeScriptTM RT Reagent Kit和TB GreenTM Premix Ex TaqTMⅡ等，購自大連TaKaRa生物工程有限公司;DMEM（高糖）培養液、Advanced DMEM培養液、Opti-MEM培養液和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）等，購自美國Invitrogen貿易有限公司;TurboFect轉染試劑，購自加拿大Fermentas公司;ERO1α兔多克隆抗體，購自臺灣Abnova生技股份有限公司;β-actin鼠單克隆抗體，購自天津三箭生物技術有限公司。

1.1.3主要儀器。Ti-E倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）;Tanon 5200全自動化學發光/熒光圖像分析系統（上海天能科技有限公司）;5810R型冷凍高速離心機（Eppendorf公司）;Bio-Rad iQ5實時熒光定量PCR儀（美國伯樂公司）。

1.2方法

1.2.1引物設計與合成。根據NCBI中小鼠ERO1α基因序列（Accession No.AF144695.2），應用Primer 5.0軟件設計ERO1α基因的特異性引物，用于CDS區的擴增，在引物5′端添加Xba I和BamH I酶切位點，引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列如下：上游引物5′-ATTCTAGAATGGGCCGCGCCTGGGG-3′（下劃線為Xba I酶切位點），下游引物5′-TGGGATCCTCAGTGAACATTCTGTAACAAGTGCCTG-3′（下劃線為BamH I酶切位點）。

1.2.2ERO1α基因擴增和重組慢病毒過表達載體的構建。利用Total RNA提取試劑盒提取RAW264.7細胞總RNA，分光光度計測定其濃度和純度。通過逆轉錄試劑盒合成cDNA，利用PrimeSTAR HS DNA Polymerase 擴增ERO1α基因的CDS區，PCR反應條件為94 ℃預變性5 min;98 ℃變性10 s，57 ℃退火5 s，72 ℃延伸1.5 min，共計30個循環;72 ℃延伸10 min。PCR產物進行核酸凝膠電泳檢測，利用膠回收試劑盒進行純化回收。回收后的片段進行末端加A反應并與pMD19-T載體連接，轉化DH5α感受態細胞，37 ℃培養過夜并提取質粒，酶切鑒定并送上海生工生物工程有限公司測序。測序正確的片段與線性化的穿梭載體pCD513B-1連接，轉化培養和提取質粒，酶切鑒定，并命名為pCD513B-ERO1α。

2.4pCD513B-ERO1α過表達效果的測定嘌呤霉素篩選后的RAW264.7細胞提取mRNA和蛋白并進行RT-qPCR和Western blot過表達效果檢測。由圖5A可知，RT-qPCR結果顯示，未處理Control組和pCD513B-1組相比無統計學差異，pCD513B-ERO1α組與Control組和pCD513B-1組相比，ERO1α的mRNA表達顯著升高（P<0.001）。由圖5B可知，Western blot結果顯示，pCD513B-ERO1α組的ERO1α蛋白表達量顯著高于Control組和pCD513B-1組。

3結論與討論

ERO1α是內質網中的重要氧化還原酶，在內質網蛋白質折疊過程中，有助于分泌蛋白和膜蛋白二硫鍵的生成[1-3]。隨著對ERO1α研究的不斷深入，研究發現ERO1α對于腫瘤對機體免疫抑制和逃避起著非常重要的作用，且過表達ERO1α有助于腫瘤的生長以及腫瘤細胞的增殖[4-7]。為了進一步研究ERO1α對機體免疫調節的分子機制，成功構建了ERO1α重組慢病毒過表達載體pCD513B-ERO1α，且穩定轉染RAW264.7細胞。

RAW264.7細胞來源于BALB/c小鼠，是一種永生化的巨噬細胞系，在研究免疫應答反應過程中起到非常重要的作用[11]。慢病毒轉導RAW264.7細胞48 h后熒光顯微鏡下能夠觀察到較強的GFP表達。該試驗采用的是第三代慢病毒載體，即四質粒系統，相比于第一代和二代慢病毒載體其生物安全性更高，病毒包裝效率更高。與其他的載體系統相比，慢病毒載體能夠攜帶較長的目的基因片段和穩定高效地轉導細胞系或原代細胞，并且不會啟動細胞的免疫應答機制[12]。慢病毒轉導RAW264.7細胞后能夠將攜帶的ERO1α基因插入到細胞自身基因組內并長期穩定表達，通過嘌呤霉素的篩選作用獲得穩定表達ERO1α的細胞克隆。細胞克隆能夠繼續培養和傳代，并保持對ERO1α的過表達效果。通過對轉導后的RAW264.7細胞的檢測，發現pCD513B-ERO1α重組慢病毒過表達載體能夠顯著增加ERO1α的過表達效果，證實該載體構建成功。

總之，該研究通過擴增ERO1α的CDS區并亞克隆到慢病毒載體pCD513B-1上，成功構建了pCD513B-ERO1α慢病毒過表達載體。通過轉導RAW264.7細胞并進行抗性篩選，成功篩選到穩定表達ERO1α的RAW264.7細胞，為后續研究ERO1α的免疫調節作用提供了技術支持。

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