慢病毒介導PNX沉默細胞株的構建與鑒定

丁毅飛 曹春雨 王憑青

摘要[目的]構建慢病毒介導的PNX沉默載體，感染GnRH分泌細胞（GT1-7）后進行篩選鑒定，獲得穩定的PNX沉默細胞株。[方法]結合RNAi干擾技術構建出慢病毒沉默載體，在293T細胞中包裝病毒并測定滴度。感染GnRH分泌細胞（GT1-7），嘌呤霉素篩選得到穩定細胞后利用Real-time PCR和Western blot檢測PNX沉默效果。[結果]慢病毒介導的PNX沉默載體構建成功，包裝的慢病毒成功感染GT1-7細胞，并且Real-time PCR和Western blot證實了PNX沉默細胞株的PNX沉默效果。[結論]成功構建了慢病毒介導的PNX沉默細胞株，為以后探索PNX對動物生殖發育的作用打下了基礎。

關鍵詞慢病毒;PNX;生殖

中圖分類號S852文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2019）02-0094-02

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.02.027

動物復雜而精密的生殖發育過程由中樞神經系統與內分泌系統共同調控，下丘腦中眾多生殖相關的神經肽信號匯聚于GnRH（Gonadotropinreleasing hormone，GnRH）神經元上，并與下丘腦-垂體-性腺（hypothalamicpituitarygonadal，HPG）軸中的各種生殖相關因子共同調控動物生殖發育過程[1]。PNX是在2013年利用生物信息學技術所發現的一個新的生殖相關肽，并且檢測到其在下丘腦及外周組織處廣泛表達，在下丘腦中的表達最高[2]。研究發現PNX可以通過結合受體GPR173調控下丘腦、垂體細胞系中某些生殖相關基因[3-4]，研究也發現PNX參與了成年大鼠發情期的調控 [2，4]，但是PNX參與生殖的調控方式仍然有許多未知的機制。筆者結合慢病毒載體以及RNAi干擾2種技術來構建慢病毒介導的PNX沉默載體，對GnRH分泌細胞系（GT1-7）進行慢病毒感染并篩選出穩定的PNX沉默細胞株，以期為進一步探索PNX在分子以及模型動物層面的生殖調控機制打下基礎。

1材料與方法

1.1主要材料和試劑

慢病毒pCDH-CMV-GFP-Puro與其輔助質粒以及限制性內切酶等購買于武漢優寶生物科技有限公司;慢病毒干擾序列與對照序列由重慶擎科合成;小鼠GnRH分泌細胞系（GT1-7）由美國加利福利亞大學Pamela Mellon教授提供;人胚腎293T細胞購買于上海中科院細胞所;質粒 DNA 提取試劑盒、切膠回收試劑盒、細胞瓶/板等購買自北京鼎國昌盛生物科技有限公司;抗PNX多克隆抗體（Bioss），HRP標記二抗（Proteintech），細胞用高糖培養基、血清、大腸桿菌（DH5α）等均購自Gibco公司。

1.2方法

1.2.1構建慢病毒介導的PNX沉默載體。

用BamHI與EcoRI 2種內切酶對pCDH-CMV-GFP-Puro載體進行雙酶切，利用切膠回收試劑盒對目的片段進行回收。對Sigma公司已驗證的PNX干擾序列及對照序列合成后，分別進行退火得到雙鏈，接著與回收的目的片段在T4連接酶作用下進行連接，將連接產物轉入大腸桿菌（DH5α），將用氨芐培養基篩選得到的陽性菌落挑出送給生物公司測序，將測序成功所獲得的質粒命名為shPNX和shCON。

1.2.2病毒合成與滴度測定。

將重組質粒shPNX和shCON分別與2種包裝質粒（PMD2G，pSPAX）按照1∶3∶4的比例共轉染293T細胞，轉染8 h后更換完全培養基培養48 h收獲1次病毒，換新的培養基后24 h再收獲1次病毒，將2次病毒合并，利用0.45 μm濾器過濾濃縮病毒后分裝于-80 ℃保存。

在24孔板中接種293T細胞，將獲得的干擾及對照病毒稀釋成不同濃度對293T細胞進行感染24 h，換完全培養基培養96 h后觀察各個組別GFP熒光差異，計算病毒滴度。

1.2.3慢病毒感染GT1-7及穩定細胞株篩選。在6孔板中接種GT1-7細胞至其生長至40%左右，用收獲的shPNX及shCON慢病毒對細胞進行感染24 h，之后與6孔板中不加慢病毒的陰性對照CON組細胞一起正常換液培養至72 h。

在熒光顯微鏡下觀察到GFP綠色熒光后利用之前實驗室已優化的1 μg/mL的puromycin篩選條件對各組GT1-7細胞進行篩選，每天利用含有1 μg/mL puromycin的新鮮培養基換液直到陰性對照CON組細胞全部死亡，即得到shPNX及shCON穩定細胞株，觀察GFP熒光后進行擴大培養。

1.2.4Real-time PCR檢測PNX沉默效果。

在12孔板中分別接種3組細胞（GT1-7，GT1-7-shCON，GT1-7-shPNX）各3孔，待細胞匯聚度在80%左右，利用試劑盒提取RNA然后進行反轉及定量PCR檢測，以β-Actin作為內參進行分析。PNX定量引物為F：5′-GCGCTCATATTCGGAGGCTT-3′，R： 5′-ACCACACTTTCAACCCTGGC-3′，β-Actin定量引物為F： 5′-ACTCCTATGTGGGTGACGAGG-3′，R：5′-CACACGCAGCTCATTGTAGAAG-3′。

1.2.5Western blot技術檢測PNX沉默效果。

在6孔板中分別接種3組細胞（GT1-7，GT1-7-shCON，GT1-7-shPNX）各3孔，待細胞匯聚度在80%左右，利用RIPA裂解液在冰上裂解細胞后，離心取上清蛋白液，利用BCA試劑盒進行定量處理后，對蛋白進行SDS-PAGE電泳、轉膜、封閉，隨后用一抗結合4 ℃冰箱過夜，用TBST洗膜3次，再用二抗室溫結合1 h后再次洗膜3次，最后在暗室進行顯影。用β-Actin蛋白作為內參。

1.2.6統計分析。

3次獨立重復試驗，數據采用軟件SPSS 20進行處理分析，數據結果以均數±標準差表示，利用單因素方差檢驗對多組數據的均數差異進行檢驗，組間采用獨立t檢驗，P<0.05被認為具有統計學意義。

2結果與分析

2.1構建shPNX和shCON載體及測序

構建shPNX和shCON載體后送往生物公司進行測序，通過DNA-MAN軟件分析后，提示成功將目的序列插入了慢病毒載體，載體構建成功。

2.2慢病毒包裝及滴度測定

shPNX和shCON慢病毒包裝后分別進行滴度測定，得到shPNX慢病毒滴度為2.2×108 TU/mL，shCON慢病毒滴度為2.5×108 TU/mL。

2.3慢病毒感染GT1-7及穩定細胞株篩選

利用shPNX和shCON慢病毒感染GT1-7后，用puromycin篩選獲得了穩定的慢病毒感染細胞株（圖1）。

2.4PNX mRNA的表達水平

shPNX組的PNX mRNA表達量（0.297）顯著低于shCON組（1.167）及陰性對照組（1.000），差異具有顯著性（P<0.01）。

2.5PNX的蛋白表達水平

shPNX組的PNX 蛋白表達量顯著低于shCON組及陰性對照組，差異具有顯著性（P<0.01，圖2）。

3討論

在研究中構建了慢病毒介導的PNX干擾載體，在感染GnRH分泌細胞株GT1-7后篩選得到了穩定的PNX沉默細胞株，并且檢測到顯著的PNX沉默效果。動物的生殖發育調控由體外環境與體內環境共同影響，由多種因子共同調控，PNX作為一個新發現的生殖肽，不僅在生殖方面存在調控作用[5-7]，還在感官處理、記憶、焦慮處理[8-10]等方面有調控作用。此次試驗所構建的慢病毒介導的PNX干擾載體以及PNX沉默的GnRH分泌細胞株，可以進一步用于探索PNX與GnRH等生殖相關肽的調控關系，也可以為以后進一步探索PNX在模式動物中的生殖調控及其他生物學作用打下基礎。

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