葉綠素缺失突變的分子機制研究進展

趙春梅

摘 要 葉綠素是光合作用中重要的色素分子，主要參與光能的吸收，其含量與光合作用效率密切相關。葉綠素缺失會直接影響植物的光合作用和生長發育。葉綠素合成受阻是導致葉綠素缺失的最直接原因，同時葉綠素合成調控、光系統的組裝、葉綠體蛋白的轉運等過程發生變化也會導致葉綠素缺失。

關鍵詞 葉綠素；缺失突變；分子機制；研究進展

中圖分類號：S652.2 文獻標志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.7.012

葉綠素缺失突變是植物界中比較常見的一種突變形式，由于葉綠素含量降低、葉片呈現黃化甚至白化現象，目前在擬南芥、煙草、番茄、甜瓜、水稻、玉米、大麥等植物中都有發現[1-7]。突變體由自然突變、人工誘變等方法獲得[8]。葉綠素是與光合作用相關的重要色素，因此葉色突變體成為研究葉綠素生物合成、光合作用機制以及葉綠體功能的重要材料；由于葉色突變表型直觀可見，還可以作為標記性狀應用于作物育種。近年來，人們在葉綠素缺失突變機制方面的研究取得了一定進展。導致葉綠素缺失突變的原因和機制比較復雜，其中分子水平上的基因突變是導致葉綠素缺失的主要原因。

1 葉綠素生物合成途徑中的基因突變

葉綠素是由含有Mg原子的卟啉環與脂肪烴側鏈構成的四吡咯大環分子，參與光合作用的光能捕獲、光能及電子的轉移。擬南芥中葉綠素生物合成從L-谷氨酰-tRNA到葉綠素a，葉綠素a再經葉綠素酸酯a加氧酶氧化即形成葉綠素b，整個生物合成過程需要15步反應，涉及由27個基因編碼的15種酶[9-10]，每一個酶基因突變都會直接影響葉綠素的合成。

葉綠素前體物質ALA合成是卟啉合成的第一步并且是此合成過程中的限速反應。在植物中ALA合成包含2個步驟：1） 谷氨酰t-RNA還原酶（GluTR）還原谷氨酰t-RNA（Glu-tRNA）生成成glutamate-1-smialdehyde（GSA）；2） Glutamate-1-semialdehyde-2，1-aminomutase （GSAM）將GSA轉化成ALA。GluTR與GSAM直接影響葉綠素的合成。在Euglena gracilis中，因底物Glu-tRNA的RNA基因發生點突變C56→U而影響葉綠素合成[11]。GSAM與葉綠素含量密切相關，在轉antisense Gsa（GSAM gene）基因植株及GSAM突變體中葉綠素含量降低甚至檢測不到[12]。ALA的合成還受植物體內GluTR結合蛋白調控。ALA轉變為葉綠素前體物質原脫植基葉綠素需要光驅動催化，如無光則導致原脫植基葉綠素積累而造成光氧化傷害。黑暗中GluTR結合蛋白FLU與GluTR結合使得谷氨酰t-RNA無法合成ALA，而另一種GluTR結合蛋白pgr7無論在有光或無光都可以與GluTR結合形成ALA，所以在黑暗情況下也有少量的ALA合成。擬南芥pgr7突變體在幼苗發育過程中葉綠素含量低[13]。

膽色素原脫氨酶（PBGD）是卟啉合成過程中的第二個限速酶。在玉米cf1突變體中PBGD含量降低，葉片呈現黃綠相間的顏色[14]。原卟啉原氧化酶（PPO，由ppo1基因編碼）是葉綠素與亞鐵血紅素共同合成途徑中一個酶，直接影響葉綠素的合成。擬南芥ppo1突變體由原卟啉原IX向原卟啉IX轉化受阻，導致原卟啉原IX大量增加，葉綠素含量降低，而亞鐵血紅素合成路徑未影響，亞鐵血紅素含量變化不大。由于葉綠素含量的降低，類囊體復合體包括PSI、PSII、細胞色素b6f復合體、ATP合酶、LHCI、LHCII的一些蛋白亞基含量都大幅降低[15]。葉綠素是含Mg的色素分子，當原卟啉IX合成后，要將Mg2+螯合到卟啉環中產生Mg-原卟啉。Mg2+螯合酶是催化該反應的關鍵酶也是限速酶，它由3個亞基CHLH、CHLD和CHLI構成[16]。Mg2+螯合酶亞基基因突變會導致葉片葉綠素缺失，在大麥chlorina-125突變體中，由于CHLI亞基突變導致淺綠葉色[17]，而水稻淺綠色突變體phyB（光敏色素B基因）則通過抑制ChlH（Mg2+螯合酶H亞基基因）和GUN4（Mg2+螯合酶激活因子基因）基因表達來調控葉綠素的合成[18]。

2 葉綠體蛋白基因突變

除了與葉綠素合成相關的基因外，植物體內其他代謝路徑中的一些酶基因變化也能夠導致葉綠素缺失。

2.1 光系統組裝蛋白突變

葉綠素主要分布于類囊體，與光系統I （PSI）、光系統II（PSII）相結合。PSI、PSII組裝受阻不能形成完整的復合體而無法正常結合葉綠素分子，導致葉片葉綠素缺失。Ycf3和Ycf4是PSI組裝蛋白，對于PSI在葉綠體中的積累必不可少[19]。煙草Ycf4敲除突變體主要影響核心復合體，導致葉綠素a/b的比率降低，葉片呈現淺綠色[20]。大麥ycf3突變體在低溫時葉色正常，當溫度升高到32 ℃時葉色變淡，葉綠素大量減少。ycf3基因由3個外顯子和2個內含子構成，內含子1屬于II組內含子，本身具有核糖酶剪切功能，并且二級結構保守。在ycf3突變體內，內含子1序列發生突變導致其RNA的二級結構不穩定。低溫對RNA二級結構影響不大，其功能也未發生較大變化，葉片顏色正常。高溫對RNA二級結構影響很大，從而干擾到內含子的剪切功能，使ycf3基因突變。Ycf3蛋白的突變使PSI的組裝及積累受影響[21]。擬南芥pyg7-1蛋白同樣與PSI組裝或穩定相關，在pyg7-1中PSI亞基雖然能夠合成，但不能形成穩定的復合體，葉片表現為葉綠素缺失[22]。PsbP是PSII的外周蛋白。在煙草中通過RNAi方式干擾PsbP的表達，LHCII–PSII超復合體的組裝或穩定性受到破壞，一些不完整的PSII中間體被破壞而進入修復循環，導致葉綠素無法與之結合[23]。TLA2基因是核基因編碼定位到葉綠體的FTSY （SRP受體）蛋白，在綠藻中葉綠體FTSY（CpFTSY）的作用是將光系統外周蛋白（LHCs）整合到類囊體膜中，tla2突變主要是影響到PSII，導致葉綠素含量下降。萊茵衣藻tla2突變體中葉綠素含量僅為野生型的20%～25%[24]。

2.2 葉綠體信號識別顆粒

葉綠體信號識別顆粒（cpSRP）的功能是引導由核基因編碼蛋白定位到葉綠體，葉綠體蛋白如果無法定位到葉綠體內相應的位置會導致葉綠素缺失。擬南芥葉綠體信號識別蛋白cpSRP43主要功能是將捕光復合物（LHC）定位到類囊體膜上。LHC通常包含幾百個葉綠素分子及數量不等的類胡蘿卜素分子，如果LHC無法定位到葉綠體中，葉綠素失去與之結合的載體，這必然導致葉綠素含量降低，擬南芥cpSRP43突變體中由核基因編碼的天線蛋白含量下降達50%左右[25]。另一葉綠體信號識別顆粒蛋白cpSRP54主要參與共翻譯及翻譯后類囊體蛋白的分選，cpSRP54突變體中也是LHC組分發生變化，光保護蛋白PsbS增加，而光系統I/II比率降低，葉綠素含量也隨之降低[26]。

2.3 RNA 聚合酶

植物葉綠體轉錄需要2種RNA聚合酶共同協作完成，一是核基因編碼的RNA聚合酶，另一是質體基因編碼的RNA聚合酶（PEP）[27-28]。RpoTp是核基因SCABRA3（SCA3）編碼的葉綠體RNA聚合酶，SCA3突變體中葉綠體基因rpoB、rpoC1、clpP和accD表達有所改變，這些亞基變化直接影響葉綠體蛋白的合成。玉米（Zea mays）中與PEP相關蛋白突變主要通過影響質體 tRNAs的轉錄導致葉綠素含量變化[27-28]。

2.4 類囊體膜蛋白及相關蛋白突變

類囊體膜蛋白或與之相關蛋白的變化也是導致葉綠素含量變化的重要因素之一。葉綠體熱休克蛋白Hsp93是一個多功能的蛋白，它是ClpP蛋白酶的分子伴侶也是葉綠體內膜易位子（TIC）的傳動組分。Hsp93是可溶性的基質蛋白，但其N-末端與類囊體膜相關并且參與葉綠體蛋白的輸入。擬南芥Hsp93突變體呈現淺綠色，轉AtHsp93V擬南芥可以恢復Hsp93突變體的葉色變淺的表型。另一分子伴侶Cpn60的功能是參與蛋白的轉運以及蛋白質的折疊作用[29]。Cpn60由6個亞基組成，包含3個α亞基和3個β亞基。OsCpn60α1是水稻葉綠體rbcL折疊的關鍵因子，oscpn60α1突變體苗期呈現淺綠色[30]。水稻非致死性白化苗是由于Rubisco小亞基突變引起，而rbcL無法正確折疊，Rubisco的功能一定受到影響，這也許是osCpn60α1突變導致葉綠素缺失的原因。

2.5 RNA編輯

RNA編輯是葉綠體中廣泛存在的現象，最典型的是將細胞器中C→U的轉換，通過RNA編輯方式可以調控基因的表達。在玉米中具有RNA編輯功能的細胞器RNA識別結構域蛋白（organellar RNA recognition motif protein，ORRM）突變導致多個RNA位點無法正確編輯，葉綠素含量降低。玉米Zm-orrm1突變體中由于petB-668、ycf3-185、ycf3-44、rpoB、rpl20、rps8等位點不能正確編輯而導致PetD、PsaD、RbcL、AtpB、PsbA等含量降低，特別是PetD、PsaD含量分別不到野生型的10%和25%。PetD、PsaD及Ycf3都是與光系統密切相關的蛋白，這些蛋白含量的降低一定會影響葉綠素的積累[31]。

3 展望

植物葉綠素缺失突變是最為直觀的突變形式，在植物中普遍存在。雖然葉綠素缺失的表型相似，但每種突變機制各有不同，并且葉綠素與光合作用密切相關，因此研究葉綠素缺失突變機制能更好地了解光合作用機制。葉綠體是半自主性細胞器，葉綠體蛋白大多數由核基因編碼合成后輸入到葉綠體中，同時葉綠體內還要進行一些蛋白的合成，導致葉綠體內生物過程比較復雜，影響葉綠素含量的因素也比較多。葉綠素合成過程相關酶突變是導致葉綠素含量降低的最直接原因，這一過程的調控蛋白也間接影響葉綠素的合成；位于類囊體膜上與葉綠素相結合的蛋白復合體如PSI、PSII以及LHCs組裝受阻也是導致葉綠素缺失的重要因素。還有些蛋白的變化與葉綠素并無直接關系，但也會導致葉綠素缺失，如分子伴侶、與RNA編輯相關的蛋白等，這對于深入研究葉綠體生理代謝過程特別是一些調控作用的研究具有重要的意義。

參考文獻：

[1] Jarvis P， Chen L J. An Arabidopsis mutant defective in the plastid general protein import apparatus[J]. Science， 1998， 282： 100-103.

[2] Kawata EE1， Cheung AY. Molecular analysis of an aurea photosynthetic mutant （Su/Su） in tobacco： LHCP depletion leads to pleiotropic mutant phenotypes[J]. EMBO J. 1990， 9（12）： 4197-4203.

[3] 郭明，張賀，李景富.番茄葉色黃化突變體的遺傳分析及SSR分子標記[J].中國蔬菜，2010（14）：31-45.

[4] 邵勤，于澤源，李興國，等.葉色黃化突變體甜瓜葉片內部生理生化變化的研究[J].中國蔬菜，2013（14）：59-65.

[5] 舒慶堯，劉貴付，夏英武.溫敏水稻葉色突變體的研究[J].核農學報，1996，10（1）：6-10.

[6] Green B A， Allred D R， Morishige T D. Hierarchical response of light harvesting Chlorophyll-Proteins in a light-sensitive chlorophyll b-deficient mutants of maize[J]. Plant Physiol， 1988， 77： 357-362.

[7] Mueller AH， Dockter C， Gough SP， et al. Characterization of mutations in barley fch2 encoding chlorophyllide a oxygenase[J]. Plant Cell Physiol， 2012， 53（7）： 1232-1246.

[8] 王吉明，馬雙武，尚建立，等.葫蘆科瓜類作物葉色突變體及其研究進展[J].安徽農業科學，2011，39（26）：16039-16040.

[9] Beale S.I. Green genes gleaned[J]. Trends in Plant Science， 2005， 10（7）： 309-312.

[10] Tanaka R， Tanaka A. Tetrapyrrole biosynthesis in higher plants[J]. Annu Rev Plant Biol， 2007， 58： 321-346.

[11] Jung HS， Okegawa Y， Shih PM， et al. Arabidopsis thaliana PGR7 encodes a conserved chloroplast protein that is necessary for efficient photosynthetic electron transport[J]. PLoS One， 2010， 5（7）： e11688.

[12] Tsang EW， Yang J， Chang Q， et al. Chlorophyll reduction in the seed of Brassica napus with a glutamate 1-semialdehyde aminotransferase antisense gene[J]. Plant Mol Biol， 2003， 51（2）： 191-201.

[13] Huang M， Slewinski TL， Baker RF， et al. Camouflage patterning in maize leaves results from a defect in porphobilinogen deaminase[J]. Mol Plant， 2009， 2（4）： 773-789.

[14] Stange-Thomann N， Thomann HU， Lloyd AJ， et al. A point mutation in Euglena gracilis chloroplast tRNA（Glu） uncouples protein and chlorophyll biosynthesis[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 1994， 91（17）： 7947-7951.

[15] Zhang F， Tang W， Hedtke B， et al. Tetrapyrrole biosynthetic enzyme protoporphyrinogen IX oxidase 1 is required for plastid RNA editing[J]. Proc Natl Acad Sci U S A， 2014， 111（5）： 2023-2028.

[16] Papenbrock J， Gr?fe S， Kruse E， et al. Mg-chelatase of tobacco： identification of a Chl D cDNA sequence encoding a third subunit， analysis of the interaction of the three subunits with the yeast two-hybrid system， and reconstitution of the enzyme activity by co-expression of recombinant CHL D， CHL H and CHL I[J]. Plant J， 1997， 12（5）： 981-990.

[17] Hansson A1， Kannangara CG， von Wettstein D， et al. Molecular basis for semidominance of missense mutations in the XANTHA-H （42-kDa） subunit of magnesium chelatase[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 1999， 96（4）： 1744-1749.

[18] Inagaki N， Kinoshita K， Kagawa T， et al. Phytochrome B Mediates the Regulation of Chlorophyll Biosynthesis through Transcriptional Regulation of ChlH and GUN4 in Rice Seedlings[J]. PLoS One， 2015，10（8）： e0135408.

[19] Boudreau E， Takahashi Y， Lemieux C， et al. The chloroplast ycf3 and ycf4 open reading frames of Chlamydomonas reinhardtii are required for the accumulation of the photosystem I complex[J]. EMBO J， 1997， 16（20）： 6095-6104.

[20] Barone P， Zhang XH， Widholm JM. Tobacco plastid transformation using the feedback-insensitive anthranilate synthaseα-subunit of tobacco （ASA2） as a new selectable marker[J]. J Exp Bot， 2009， 60（11）： 3195-3202.

[21] Landau AM， Lokstein H， Scheller HV， et al. A cytoplasmically inherited barley mutant is defective in photosystem I assembly due to a temperature-sensitive defect in ycf3 splicing[J]. Plant Physiol， 2009， 151（4）： 1802-1811.

[22] St?ckel J， Bennewitz S， Hein P， et al. The evolutionarily conserved tetratrico peptide repeat protein pale yellow green7 is required for photosystem I accumulation in Arabidopsis and copurifies with the complex[J]. Plant Physiol， 2006， 141（3）： 870-878.

[23] Ifuku K， Yamamoto Y， Ono TA， et al. PsbP protein， but not PsbQ protein， is essential for the regulation and stabilization of photosystem II in higher plants[J]. Plant Physiol， 2005， 139（3）： 1175-1184.

[24] Kirst H， García-Cerdán JG， Zurbriggen A， et al. Assembly of the light-harvesting chlorophyll antenna in the green alga Chlamydomonas reinhardtii requires expression of the TLA2-CpFTSYgene[J]. Plant Physiol， 2012，158（2）： 930-945.

[25] Amin P， Sy DA， Pilgrim ML， et al. Arabidopsis mutants lacking the 43- and 54-kilodalton subunits of the chloroplast signal recognition particle have distinct phenotypes[J]. Plant Physiol， 1999， 121（1）： 61-70.

[26] Rutschow H， Ytterberg AJ， Friso G， et al. Quantitative proteomics of a chloroplast SRP54 sorting mutant and its genetic interactions with CLPC1 in Arabidopsis[J]. Plant Physiol， 2008， 148（1）： 156-175.

[27] Hricová A， Quesada V， Micol JL. The SCABRA3 nuclear gene encodes the plastid RpoTp RNA polymerase， which is required for chloroplast biogenesis and mesophyll cell proliferation in Arabidopsis[J]. Plant Physiol， 2006， 141（3）： 942-956.

[28] Williams-Carrier R， Zoschke R， Belcher S， et al. A major role for the plastid-encoded RNA polymerase complex in the expression of plastid transfer RNAs[J]. Plant Physiol， 2014， 164（1）： 239-248.

[29] Chu CC， Li HM. The amino-terminal domain of chloroplast Hsp93 is important for its membrane association and functions in vivo[J]. Plant Physiol， 2012， 158（4）： 1656-1665.

[30] Kim SR， Yang JI， An G. OsCpn60α1， encoding the plastid chaperonin 60α subunit， is essential for folding of rbcL[J]. Mol Cells， 2013， 35（5）： 402-409.

[31] Sun T， Germain A， Giloteaux L， et al. An RNA recognition motif-containing protein is required for plastid RNAediting in Arabidopsis and maize[J]. Proc Natl Acad Sci U S A， 2013， 110（12）： 1169-1178.

（責任編輯：敬廷桃）