雞傳染性支氣管炎病毒Real-Time PCR檢測方法的建立

張會 趙魯 連銳銳 張子越 趙曉月 潘力 李智勇

摘? 要：本試驗針對腎型雞傳染性支氣管炎病毒（IBV-QX）保守基因N基因設計并合成引物，構建了陽性質粒標準品;經過不斷優化建立了檢測IBV-QX SYBR Green Ⅰ Real-Time PCR標準曲線。結果顯示，本次所建立的檢測方法重復性好，特異性高，最低可檢測到39.7copies/μl的病毒核酸，對常見禽源病毒無交叉反應。本次建立的方法不僅可以用于各基因型IBV病原檢測，也可用于病毒的定量研究。因此，本實驗室所建立的IBV檢測方法在雞傳染性支氣管炎病毒的快速檢測上具有重要意義。

關鍵詞：雞傳染性支氣管炎病毒;Real-Time PCR;病毒檢測;熒光定量

中圖分類號：S858.31? ? ?文獻標識碼：B? ? ?文章編號：1673-1085（2019）2-0020-04

傳染性支氣管炎（Infectious Bronchitis，IB）是由傳染性支氣管炎病毒（IBV）引起的高度接觸傳染性疾病，IBV屬冠狀病毒科冠狀病毒屬。IBV感染主要引起雞的呼吸道、腎臟和生殖道病理變化，導致被感染雞群發病而造成巨大經濟損失[1]。IBV的不同血清型之間幾乎沒有交叉保護，不斷出現新的IBV血清型是預防和控制IB的主要挑戰[2]。調查顯示，QX基因型IBV是我國近幾年主要流行的毒株之一[3]，常規RT-PCR方法以其簡單、快捷的特點被各實驗室用作IBV的實驗室診斷方法，但該方法不能用于IBV的定量檢測，并且對病毒含量很低的病料也不能夠很好地檢出。為此，建立一種特異性高、重復性好、敏感性高的IBV實驗室檢測方法將有助于雞傳染性支氣管炎疫情的防控，從而將損失將至最低。

1? 材料與方法

1.1? 試驗材料

1.1.1? 病毒株? IBV-QX毒株由山東省農業科學院家禽研究所山東省禽病診斷與免疫重點實驗室惠贈。

1.1.2? 試驗動物? 9日齡 SPF雞胚購自山東昊泰實驗動物繁育有限公司，用于病毒復蘇。

1.1.3? 試驗試劑與主要試驗儀器? 瓊脂糖DNA凝膠回收試劑盒、體液病毒DNA/RNA提取試劑盒購自康寧生命科學（吳江）有限公司;熒光定量試劑盒、反轉錄體系試劑購自山東賽恩斯科技有限公司;DL-2000Marker、2xTaq PCR Star Mix、感受態細胞、pMD18-T載體、質粒小提試劑盒均購自北京全式金生物技術有限公司。PCR儀、電泳儀、凝膠成像儀均購自杭州博日科技有限公司;Real-Time PCR儀（LightCycler 96）購自德國羅氏診斷有限公司;紫外凝膠成像儀（Alpha Imager HP）購自美國Protein Simple公司;干式恒溫器、紫外透射反射分析儀、自動核酸提取儀購自西安天隆科技有限公司;超微量分光光度計（K5600）購自南京旭析儀器有限公司。

1.2? 試驗方法

1.2.1? SYBR Green Ⅰ Real-Time PCR引物的設計與陽性質粒標準品的制備? 根據IBV-QX的N基因序列（GenBank 中登錄號為AY761141.1）。利用primer premier6.0軟件設計了引物。引物：上游5'-GTA GCC TGG AAA CGA ACG G -3'，下游，5'-TCC TAG TGC TGT ACC CTC GG -3'，片段大小186bp，引物由青島英賽特生物科技有限公司合成。采用TaKaRa公司生產的反轉錄試劑盒將所提核酸反轉錄成cDNA，反應體系20μl，1μl通用引物（50 pmol/μl）、4μl模板，其他反轉錄成分按照試劑盒說明使用;反轉錄條件：25℃ 5min，42℃ 60min，70℃ 5min。將獲得的cDNA進行常規 PCR擴增。PCR反應體系25μl，上、下游引物各0.4μl（20 pmol/μl），2μl模板，用ddH2O補至25μl，其他成分按照說明書加入。PCR反應條件：預變性95℃ 2min;變性95℃ 30s;退火55℃ 30s;延伸72℃ 45s;共33個循環;重延伸72℃ 10min。將PCR產物進行電泳，按照瓊脂糖DNA凝膠回收試劑盒說明回收目的片段，將回收的目的基因連接轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞中，過夜培養，挑單菌落，進行陽性鑒定，將陽性單菌落搖菌提質粒，并將所提質粒送生物公司測序。

1.2.2? IBV-M41 SYBR Green Ⅰ Real-Time PCR標準曲線建立? 采用超微量分光光度計（K5600）測定所提質粒濃度。根據相關公式計算其相應拷貝數[4]。將所得質粒梯度稀釋后按照以下體系與反應條件：反應體系為20μl，Mix 10μl、ddH2O 7.2μl、上、下游引物各0.4μl、模板2μl。預變性95℃ 120s;變性95℃ 15s;退火55℃15s;延伸72℃ 25s;溶解曲線跟隨儀器自設系統，45個循環，設置三個空白對照，儀器自動采集熒光信號，空白對照為陰性時，結果可信。

1.2.3? 敏感性試驗? 將IBV-QX的陽性質粒標準品進行10倍梯度稀釋，稀釋至測定熒光定量PCR儀所能檢出的最低濃度，并同時進行普通PCR方法檢測，比較二者的敏感性。

1.2.4? 特異性試驗? 取H9N2亞型禽流病毒（AIV-H9N2）、禽偏肺病毒（APV）、雞傳染性貧血病毒（CAV）、新城疫病毒（NDV）、傳染性法氏囊病毒（IBDV）、傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）、雞毒支原體（MG）、禽白血病病毒（ALV）和IBV-QX的cDNA按本試驗優化好的方法同時進行Real-Time PCR檢測，以檢驗所建立的標準曲線的特異性。

1.2.5? 重復性試驗? 批間重復性試驗： 取6個10倍梯度稀釋的陽性質粒標準品在同一條件下進行3次獨立的Real-Time PCR檢測。

批內重復性試驗：取6個10倍梯度稀釋的陽性質粒標準品，每個梯度3個重復，進行Real-Time PCR檢測。

2? 結果與分析

2.1? 普通PCR鑒定重組質粒結果? 將構建的標準質粒進行普通PCR擴增、電泳，目的核酸片段大小為186bp。見圖1。

2.2? 標準曲線建立與其靈敏度和特異性驗證結果

2.2.1? 標準曲線的靈敏度? 此次Real-Time PCR標準曲線最低可檢測到39.7copies/μl的病毒cDNA，比普通RT-PCR靈敏度高出100倍，目的核酸片段大小為186bp。結果見圖2。

2.2.2? 擴增曲線的重復性? 由結果統計分析得出，批間變異系數（CV）小于1.5%，批內變異系數（CV）小于0.6%，重復性良好，符合試驗要求。結果見圖3。

2.2.3? 標準曲線的特異性? 所取AIV-H9N2、APV、CAV、NDV、IBDV、ILTV、MG、ALV和IBV-QX的核酸按本試驗優化好的方法同時進行Real-Time PCR檢測，除了IBV-QX外的其它病毒cDNA 對應孔均未出現熔解曲線，證明本次建立的Real-Time PCR檢測方法的特異性強，符合試驗要求。結果見圖4。

2.2.4? 標準曲線相關參數? 測得質粒濃度為：128ng/μl，OD260/230=2.53，OD260/280=1.80，計算得出其原始拷貝數為3.97×1010copies/μl;不斷優化試驗方法后建立了對應的標準曲線：Y=-3.7924x+38.32，R2=1.0，Efficiency=2.01，Error=0.35，各項數據均符合試驗要求。

3? 討論

最新流調表明，目前QX基因型IBV已占我國流行毒株的70%左右，由于RNA聚合酶缺乏校正能力，使得IBV極易發生變異，新的血清型和基因型不斷出現，不同毒株之間免疫交叉保護并不理想[5-6]。基于以上客觀原因，本實驗室經過不斷優化試驗條件，建立了IBV SYBR Green Ⅰ Real-Time PCR的檢測方法，通過以上試驗結果可以得出：與傳統RT-PCR檢測方法相比，Real-Time PCR法靈敏度更高，這對養殖場早期雞傳染性支氣管炎病毒的防控具有重要意義，同時，本實驗室根據IBV保守基因設計引物而建立的檢測方法，可用于不同基因型、血清型的IBV病毒定量檢測和被感染動物相關器官病毒載量研究。

參考文獻：

[1]? Cook J K， Jack wood M， Jones R C. The long view：40 years of infectious bronchitis research.[J]. Avian Pathology， 2012， 41（3）：239-250.

[2]? Cavanagh D. Coronavirus avian infectious bronchitis virus[J].Veterinary Research， 2007， 38（2）：281.

[3]? 陳良珂，封柯宇，李鴻鑫，等.2013～2017年雞傳染性支氣管炎病毒分子流行病學分析[J].中國家禽，2018，40（15）：16-20.

[4]? 劉喬然，劉勝旺.雞傳染性支氣管炎病毒Real-time PCR方法的建立及其對感染雞體內病毒的檢測[J].中國預防獸醫學報，2008，30（8）：36-41.

[5]? Han Z， Sun C， Yan B， et al. A 15-year analysis of molecular epidemiology of avian infectious bronchitis coronavirus in China[J].Infection Genetics & Evolution， 2011，11（1）：190-200.

[6]? Benyeda Z， Szeredi L， Mató T， et al. Comparative histopathology and immunohistochemistry of QX-like，Massachusetts and 793/B serotypes of infectious bronchitis virus infection in chickens[J].Journal of Comparative Pathology， 2010， 143（4）：276-283.