病死雞尸體發酵堆肥中蛋白酶分解菌的分離鑒定及發酵工藝的研究

郭芳先 肖發沂 馮傳明 陳永科 劉鎮

摘? 要：從雞場病死雞自然發酵堆肥中取樣，分離篩選得到一株產蛋白酶活性高（揺瓶培養基酶活為2000U/ml）的菌株，經過鑒定，該菌株為解淀粉芽孢桿菌。本文通過不斷優化該菌株的產芽孢培養基及其發酵工藝，最終確定了該菌在100～2000L發酵罐的發酵工藝，放罐芽孢數可達3.1×1010CFU/ml，芽孢率≥98%。

關鍵詞：解淀粉芽孢桿菌;分離鑒定;發酵

中圖分類號：S858.314.4+3? ? ?文獻標識碼：B? ? ?文章編號：1673-1085（2019）02-0024-03

病死動物尸體堆肥發酵因其簡單實用、經濟環保并能產生穩定高效植物肥料的特點，已成為病死動物尸體無害化處理的主流方式，也是符合我國養殖業現狀的合理有效的處理方式之一[1]。但是傳統的堆肥法主要依靠自然界的微生物進行發酵，發酵過程受環境溫度、原材料等因素的影響，發酵效率太低，且占地面積較大。本研究主要是從傳統病死雞尸體發酵堆肥中篩選分解蛋白酶的優勢微生物，并研究這些微生物的發酵工藝，將其制備成菌劑，提高病死雞尸體發酵堆肥的效率。

1? 材料與方法

1.1? 樣品? 采用四點取樣法取濰坊市某養雞場病死雞尸體自然發酵的好氧堆肥升溫期的樣品。

1.2? 培養基

1.2.1? 牛肉膏蛋白胨培養基（NA）：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，瓊脂粉20g，蒸餾水1000ml，pH7.0。

1.2.2? 高氏1號培養基：可溶性淀粉20g，氯化鈉0.5g，硝酸鉀1g，三水磷酸氫二鉀0.5g，七水硫酸鎂0.5g，七水硫酸亞鐵0.01g，瓊脂粉20g，蒸餾水1000ml，pH7.5。

1.2.3? 真菌培養基采用含有氯霉素的馬鈴薯瓊脂培養基（PDA），青島海博生產。

1.2.4? 蛋白酶菌株篩選培養基：磷酸二氫鉀0.36g/L，硫酸鎂0.5g/L，氯化鋅0.014g/L，磷酸氫二鈉1.07g/L，氯化鈉0.16g/L，氯化鈣0.002g/L，硫酸亞鐵0.002g/L，干酪素4g/L，胰酪胨0.05g/L，瓊脂粉20g/L，pH6.8～7.0。

1.3? 試驗材料? 包括豆粕、玉米粉、玉米淀粉、葡萄糖、玉米漿、氯化銨、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸錳、氯化鈉等。

1.4? 試驗設備? 有干燥箱、滅菌鍋、搖床、培養箱、50L全自動發酵罐、100～2000L發酵罐等。

1.5? 試驗方法

1.5.1? 產蛋白酶菌株的篩選及分離鑒定? 稱取10g樣品與滅菌的裝有90ml生理鹽水的錐形瓶中，在搖床上充分震蕩30min，采用稀釋涂布平板法將10-4、10-5、10-6三個梯度各100μl分別涂布于NA、高氏1號培養基和PDA平板中。每個梯度做4個重復，NA平板放在37℃培養箱中培養1～2d，高氏1號培養基平板和PDA平板放在30℃培養箱中培養3～4d。然后挑選不同形態的菌落分別接種至蛋白酶菌株篩選培養基中培養，細菌菌落放在37℃培養箱中培養1～2d，放線菌和真菌菌落放在30℃培養箱中培養3～4d，觀察透明圈。將有透明圈的菌落進一步分離純化，然后進行保存，并將斜面菌種送至鑒定機構進行菌種鑒定。

1.5.2? 解淀粉芽孢桿菌產芽孢培養基及發酵工藝的研究

1.5.2.1? 搖瓶配方試驗? 選擇各種發酵常用物料，進行搖瓶配方的摸索，通過多次正交試驗，初步確定發酵配方。

1.5.2.2? 2000L發酵罐配方試驗? 在搖瓶配方初步確定的基礎上進行50L發酵罐小試，然后用100～2000L發酵罐進行中試，最終確定該菌的發酵配方。

1.5.2.3? 100～2000L發酵罐發酵工藝的研究? 對發酵罐的通風量和轉速進行調整，以促進菌種的快速繁殖。

2? 結果與分析

2.1? 產蛋白酶菌株的篩選及分離鑒定

2.1.1? 產蛋白酶菌株的篩選? 經過多輪篩選，最后只有1#菌株在蛋白酶篩選培養基平板上有透明圈，將1#菌株接種至蛋白酶揺瓶培養基培養，檢測發酵液酶活，平均酶活為2000U/ml，1#菌株在NA平板和蛋白酶篩選平板上的菌落形態見圖1所示。

2.1.2? 1#菌株分離鑒定結果? 經過鑒定機構的鑒定，1#菌株為解淀粉芽孢桿菌。

2.2? 解淀粉芽孢桿菌產芽孢培養基及發酵工藝的研究

2.2.1? 揺瓶配方試驗? 通過多次揺瓶實驗，檢測揺瓶菌數及芽孢率，最后確定該菌種的揺瓶發酵配方碳源為玉米淀粉、葡萄糖，氮源為豆粕、氯化銨，無機鹽為硫酸鎂、硫酸錳等。

2.2.2? 2000L發酵罐配方試驗? 上述揺瓶配方適當增加濃度分別進行50L罐小試，100～2000L發酵罐中試，多次重復實驗結果（取平均值）如表1。

從表1數據可以看出，50L的發酵配方為搖瓶配方中各組分均增加0.5倍，2000L發酵罐的發酵配方為揺瓶配方中的各組分均增加1倍，放罐芽孢數最高。適當增加揺瓶配方中各組分的濃度有利于提高發酵的放罐芽孢數，這是因為2000L發酵罐的溶解氧比50L發酵罐和三角瓶中的溶解氧效果都好。但是如果配方濃度太大，造成培養基中缺氧，反而容易引起菌體的死亡，不易形成芽孢，影響最終的芽孢數量。

2.2.3? 100～2000L發酵罐發酵工藝的研究? 在菌種發酵過程中，通過提高發酵罐中的通風量和提高轉速，有利于為菌種提供更多的溶解氧，從而促進菌種的快速繁殖，縮短發酵時間，節約發酵成本。表2和表3分別是調整發酵罐的通風量和轉速對發酵時間和放罐芽孢數的影響。

從表2、表3中可以看出，有效的調整通風量和發酵罐的轉速，可以明顯縮短菌種的發酵時間，但是對放罐芽孢數基本沒有影響。

3? 結論與分析

該研究從濰坊某養雞場尸體堆肥中分離出了一株產蛋白酶酶活較高的解淀粉芽孢桿菌，經揺瓶實驗，蛋白酶酶活可達2000U/ml。近年來，有研究發現解淀粉芽孢桿菌能夠產蛋白酶[2，3]，但是大部分都分離自土壤，主要用來做飼料添加劑，用于做尸體發酵方面的報道很少。

芽孢是細菌休眠體，產芽孢細菌在營養條件缺乏時，在細胞內形成圓形或橢圓形的芽孢休眠體。芽孢含水量極低，抗逆性強，能經受高溫、紫外線、電離輻射以及多種化學物質滅殺等，條件適宜時，芽孢會重新成為一個細菌[4];由于芽孢較其營養體細胞易保藏、復活率高，是制備菌粉制劑的理想存在形式，所以本研究通過多次反復試驗確定了解淀粉芽孢桿菌的2000L發酵罐的產芽孢培養基，并對其發酵工藝進行了優化，縮短了該菌的發酵時間（由原來的25h縮短為20h），降低了發酵成本，為以后制備病死雞堆肥發酵菌劑提供了基礎。

參考文獻：

[1]? 續彥龍，王麗麗，龔改林，等.堆肥法無害化處理染疫動物尸體的研究進展[J].畜牧與獸醫，2015，47（4）：138-140.

[2]? 謝為天，李紅勝，劉穎，等.一株源于紅樹林土壤芽孢桿菌的鑒定及其蛋白酶學性質研究[J].廣東農業科學，2014，41（9）：155-158.

[3]? 付文娟，楊亞晉，王慶，等.高產蛋白酶菌株的篩選及其提高發酵豆粕肽含量效果研究[J].中國畜牧雜志，2013，49（23）：41-46.

[4]? Higgins D，Dworkin J.Recent progress in Bacillus subtilis sporulation[J].Fems Microbiology Reviews，2012，36（1）：131-148.