艾塞那肽減輕阿霉素引起的心肌細(xì)胞凋亡

方俊濤 ，蔡 璨 ，王麗娟 ，張小慢 ，劉尚雨 ，李 萍

（1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院阜外醫(yī)院，國家心血管病中心 心血管病國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100037；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院阜外醫(yī)院 心血管內(nèi)科，國家心血管病中心 內(nèi)分泌與心血管代謝中心，北京 100037）

阿霉素是一種廣譜高效的抗癌藥物，然而其致命的心臟毒性極大地限制了在臨床上的應(yīng)用[1]。阿霉素所致心臟毒性的機(jī)制非常復(fù)雜的，包括活性氧（reactive oxygen species，ROS）的過量產(chǎn)生，細(xì)胞膜完整性的破壞及細(xì)胞凋亡[2]。ROS的激活可引起DNA的過氧化損傷，導(dǎo)致線粒體膜通透性變化和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[3]。這些因素相互作用，共同導(dǎo)致了阿霉素心臟毒性的發(fā)生和發(fā)展。

胰高血糖素樣肽1（glucagon-likepeptide1，GLP-1）是由腸內(nèi)分泌L細(xì)胞產(chǎn)生的一種腸促胰素，它通過與GLP-1受體結(jié)合發(fā)揮降糖作用。艾塞那肽是一種GLP-1受體激動劑，研究表明，它除了降糖作用外還具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗凋亡、改善心肌梗死等心血管保護(hù)作用[4，5]。然而，艾塞那肽對阿霉素致心肌細(xì)胞凋亡是否具有保護(hù)作用，國內(nèi)外鮮見報道。本研究旨在探討艾塞那肽對阿霉素所致心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

MTT活性檢測試劑盒、Caspase3、Caspase9活性檢測試劑盒、線粒體膜電位（△Ψm）檢測試劑盒（JC-1）、一步法TUNEL試劑盒及ROS檢測試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)研究所，Annexin-V和PI雙染色法試劑盒購于BD Biosciences公司，阿霉素購于大連美侖生物技術(shù)有限公司，艾塞那肽購于MCE公司，DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清購自Gibco公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與處理

H9c2大鼠心肌細(xì)胞株來源于美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心（ATCC）。將H9c2細(xì)胞置于含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)。對心肌細(xì)胞進(jìn)行饑餓24h處理后，阿霉素組給予阿霉素（10μM）刺激24h，艾塞那肽干預(yù)組在給予阿霉素0.5h前用艾塞那肽（30nM）進(jìn)行預(yù)處理。

1.3 MTT試劑盒檢測H9c2細(xì)胞活性

按5×107個/孔將H9c2細(xì)胞接種于96孔板，當(dāng)細(xì)胞生長到80%左右融合時進(jìn)行分組處理，每個組設(shè)3個復(fù)孔。處理結(jié)束后，每孔加入10μl MTT溶液繼續(xù)孵育4h，然后每孔再加入100μl Formazan溶解液，混勻后37℃孵育4h左右，在570nm測定吸光度（OD）。取3孔OD值的平均數(shù)，計算細(xì)胞活性:細(xì)胞活性=處理組OD/對照組OD×100%。

1.4 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡

利用一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒檢測3組細(xì)胞的凋亡情況。按5×107個/孔將H9c2細(xì)胞接種于12孔板，當(dāng)細(xì)胞生長到80%左右時進(jìn)行分組處理，每個組設(shè)3個復(fù)孔。處理結(jié)束后，用PBS洗滌2次。在樣品上加50μl TUNEL檢測液，37℃避光孵育60min。用PBS洗滌3次后用抗熒光淬滅封片液封片，并在熒光顯微鏡下觀察。Cy3的激發(fā)波長為550nm，發(fā)射波長為570nm。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

采用Annexin-V和PI雙染色法測定細(xì)胞凋亡。用4℃的PBS清洗心肌細(xì)胞2次，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106個/孔，在細(xì)胞中分別加入FITC標(biāo)記的Annexin-V和PI各5μl。采用Accuri C6流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測分析。

1.6 細(xì)胞內(nèi)ROS水平檢測

將H9c2細(xì)胞均勻接種于12孔板上，當(dāng)細(xì)胞長到約80%時給予不同處理。按照1:1000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度10μmol/L。去除細(xì)胞培養(yǎng)液，在12孔板的1個孔中加入1ml稀釋好的DCFH-DA，37℃孵育20min。用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。收集細(xì)胞后在488nm激發(fā)波長，525nm發(fā)射波長用熒光酶標(biāo)儀檢測。

1.7 Caspase3與Caspase9活性檢測

H9c2細(xì)胞經(jīng)不同處理后，用胰酶消化貼壁細(xì)胞，并收集至備用的細(xì)胞培養(yǎng)液中，以600g離心5min收集細(xì)胞，PBS洗滌1次。按照每200萬細(xì)胞加入100μl裂解液的比例加入裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解15min后18000g離心15min，把上清轉(zhuǎn)移到冰浴預(yù)冷的離心管中，并測定蛋白濃度。根據(jù)試劑盒步驟配好反應(yīng)體系，37℃孵育2h，出現(xiàn)顏色變化較明顯時即可測定A405。

1.8 線粒體膜電位（JC-1）檢測

當(dāng)細(xì)胞長至約80%時，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計給予不同處理。用胰酶消化后收集細(xì)胞，重懸于0.5ml細(xì)胞培養(yǎng)液中，加入0.5ml JC-1染色工作液，混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育20min。孵育結(jié)束后，600g離心4min，沉淀細(xì)胞，棄上清，用JC-1染色緩沖液（1×）洗滌 2次，再用適量 JC-1染色緩沖液（1×）重懸后，用熒光酶標(biāo)儀檢測。當(dāng)線粒體膜電位比較高時，JC-1會聚集在線粒體基質(zhì)中形成聚合物而產(chǎn)生紅色熒光；當(dāng)線粒體膜電位比較低時，JC-1不能聚集于線粒體基質(zhì)中，此時JC-1為單體，會發(fā)出綠色熒光。這樣就可以很方便地借助熒光顏色的變化來檢測線粒體中的膜電位變化。常用紅色綠色熒光的相對比值來衡量線粒體去極化的程度。

1.9 實(shí)時熒光定量PCR檢測

各組細(xì)胞在37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)24h后，通過RT-PCR檢測每組細(xì)胞的Bcl-2及Bax mRNA表達(dá)水平，計算Bcl-2/Bax比值。設(shè)計的引物如下:Bcl-2上游引物:5‘CTTCAGGGATGGGGTGAACT’3，下游引物:5‘CAGCCTCCGTTATCCTGGAT’3；Bax上游引物:5‘TCATGAAGACAGGGGCCTTT’3，下游引物:5‘GTCCACGTCAGCAATCATCC’3；GAPDH上游引物:5‘GGTTGAGTGAGCAGTTCAC’3，下游引物:5‘GATAACCAGACCACACCTTAGC’3。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 艾塞那肽對阿霉素誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡的影響

與空白組相比，阿霉素組H9c2心肌細(xì)胞凋亡率顯著增加（流式細(xì)胞檢測法:P＜0.01；TUNEL法:P＜0.01）；與阿霉素組相比，艾塞那肽組H9c2心肌細(xì)胞凋亡率顯著減少（流式細(xì)胞檢測法:P＜0.01；TUNEL 法:P＜0.05），見圖1、2（插二）。

2.2 艾塞那肽對阿霉素誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞活性的影響

表1示，與對照組相比，阿霉素組H9c2心肌細(xì)胞活性顯著下降（P＜0.01）；給予艾塞那肽處理后H9c2心肌細(xì)胞活性顯著增加（P＜0.05）。

2.3 艾塞那肽對阿霉素誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞ROS、Caspase3、Caspase9 活性的影響

表1示，與對照組相比，阿霉素組H9c2心肌細(xì)胞 ROS、Caspase3、Caspase9活性顯著增加（P＜0.01）；給予艾塞那肽預(yù)處理后H9c2心肌細(xì)胞ROS、Caspase3、Caspase9 活性顯著下降（P＜0.05）。

2.4 艾塞那肽對阿霉素誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞△Ψm、Bcl-2/Bax比值的影響

表1示，與對照組相比，阿霉素組H9c2心肌細(xì)胞△Ψm、Bcl-2/Bax比值顯著下降（P＜0.01）；與阿霉素組相比，艾塞那肽組H9c2心肌細(xì)胞△Ψm、Bcl-2/Bax比值顯著增加（P＜0.01）。

3 討論

3.1 阿霉素與心肌細(xì)胞凋亡

阿霉素是臨床上常用的抗腫瘤藥物，它的嚴(yán)重心臟毒性大大限制了臨床應(yīng)用。因此，尋找能夠減輕這種不良反應(yīng)又不影響阿霉素的抗腫瘤功能的心臟保護(hù)劑是亟需解決的問題。阿霉素所致的心臟毒性具體機(jī)制目前尚未十分清楚，但普遍認(rèn)為阿霉素所引起的心肌細(xì)胞凋亡及ROS的大量生成是心臟損傷的重要機(jī)制。

大量研究表明，心肌細(xì)胞凋亡參與到多種心血管疾病的發(fā)病過程中。細(xì)胞凋亡指的是基因水平調(diào)控的一種程序性自主死亡過程[6]。細(xì)胞凋亡的機(jī)制非常復(fù)雜，目前普遍認(rèn)為細(xì)胞凋亡主要通過以下3種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來實(shí)現(xiàn)，包括線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的凋亡途徑和死亡受體介導(dǎo)的凋亡途徑[7]。此外，一些凋亡相關(guān)的基因也參與到其中，包括:Bcl-2家族和Caspase家族。因此，如何減輕心肌細(xì)胞的凋亡，是當(dāng)前細(xì)胞分子生物學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

3.2 阿霉素與△Ψm異常

當(dāng)阿霉素作用于心肌細(xì)胞后，線粒體中呼吸鏈功能出現(xiàn)異常，產(chǎn)生大量ROS，增加了線粒體膜的通透性，導(dǎo)致△Ψm下降，從而激發(fā)Caspases的凋亡級聯(lián)反應(yīng)，活化Caspase3等，而Caspase3是細(xì)胞凋亡過程中最重要的蛋白酶，是細(xì)胞凋亡出現(xiàn)的標(biāo)志酶，激活后的Caspase3能改變細(xì)胞形態(tài)及降解DNA，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8]。研究表明，用不同的處理方式誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中，均可以發(fā)現(xiàn)△Ψm在細(xì)胞形態(tài)變化前有一定程度的下降，說明△Ψm的下降是細(xì)胞凋亡早期的一個標(biāo)志性事件。當(dāng)△Ψm出現(xiàn)損耗時，細(xì)胞即進(jìn)入了凋亡過程。

表1 艾塞那肽對阿霉素誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞活性、ROS等指標(biāo)的影響

3.3 艾塞那肽對阿霉素引起心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用

除了Caspase家族外，Bcl-2基因家族也是參與細(xì)胞凋亡調(diào)控的重要調(diào)控基因[9]。Bcl-2和Bax同屬于Bcl-2家族成員，在凋亡調(diào)控中發(fā)揮重要作用。Bcl-2具有對抗細(xì)胞凋亡功能，通過抑制細(xì)胞色素C的釋放，進(jìn)而抑制下游Caspases的激活，發(fā)揮其抗凋亡作用[10]。而Bax則具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，當(dāng)細(xì)胞凋亡發(fā)生時，Bcl-2/Bax比值下降，Bcl-2/Bax比值常被用于描述細(xì)胞凋亡的程度。研究表明，線粒體介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡途徑在阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性中扮演重要角色[11，12]。由于胞內(nèi)ROS大量生成及ATP消耗使得Bax從細(xì)胞液轉(zhuǎn)移到線粒體中，Bcl-2/Bax比值降低，這導(dǎo)致細(xì)胞色素C的釋放及Caspase3、Caspase9的激活，引起心肌細(xì)胞凋亡[13]。研究表明，GLP-1類似物艾塞那肽具有抗炎、抗動脈粥樣硬化、減輕心肌缺血再灌注損傷、抑制心肌細(xì)胞凋亡等心血管保護(hù)作用。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)TUNEL法和流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果提示阿霉素組H9c2細(xì)胞凋亡率顯著增加，阿霉素能夠引起H9c2細(xì)胞活性降低，細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，△Ψm降低，Bcl-2/Bax比值下降，給予艾塞那肽干預(yù)后則能顯著改善這些不良作用，這提示艾塞那肽能夠?qū)拱⒚顾匾鹦募〖?xì)胞凋亡。

綜上所述，艾塞那肽能夠改善阿霉素引起的心肌細(xì)胞凋亡，這為防治阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性提供新的思路。其作用機(jī)制可能是減少細(xì)胞內(nèi)ROS的生成，增加△Ψm，降低Bcl-2/Bax比值，從而減少阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。