miR-26b對口腔鱗癌細(xì)胞SCC15腫瘤干性的抑制作用

鐘文德 嘉紅云 陳廣盛

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院（廣州510260）

口腔癌是頭頸腫瘤的主要類型，其中大部分為口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）［1］。盡管近年對OSCC的早期診斷和治療有明顯提高，但患者5年生存率仍不足50%［2］。腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells，CSCs）的存在是腫瘤復(fù)發(fā)的關(guān)鍵，而上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial to mesenchyrnal transition，EMT）的發(fā)生是癌細(xì)胞獲得干細(xì)胞樣表型的重要途徑，miRNAs 與癌細(xì)胞干性的獲得密切相關(guān)［3］。FAN等［4］指出過表達(dá)miR-26b可促進(jìn)結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系的EMT和干細(xì)胞樣表型獲得而增加腫瘤致病性，有趣的是FUKUMOTO［5］研究卻發(fā)現(xiàn)miR-26b 對OSCC 具有抑癌作用。但miR-26b 對口腔癌細(xì)胞腫瘤干性的影響到底如何尚無報道。本研究希望通過探討miR-26b 對人口腔鱗癌細(xì)胞SCC15 干性的影響，為上述問題提供實驗依據(jù)，同時為OSCC 治療靶點的尋找提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑胎牛血清和DMEM 培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司，miRNA 分離試劑購自美國Ambion公司，miRNA-26b 特異性引物和探針、TaqMan miRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒和TaqMan miRNA 檢測試劑盒均購自美國Applied Biosystems 公司。TRIzol 溶液、Lipofectamine 2000 購自美國Invitrogen 公司。miR-26b 模擬物、miR-26b 抑制物、陰性對照、miR-26b 特異性PCR 引物購自廣州銳博生物。β-actin 及E-鈣粘蛋白抗體購自Cell Signal 公司。

1.2 研究對象5例口腔鱗癌患者均來自2015年至2017年到我院就診病人，男4例，女1例，年齡48～72歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者病灶位置的病理標(biāo)本均已確診。其中伴淋巴轉(zhuǎn)移者2例，未轉(zhuǎn)移者3例；病灶位置分類：舌癌4例，牙齦癌1例；WHO 病理分級：高分化4例，低分化1例；取患者各自癌旁正常口腔組織作為對照組。人口腔鱗狀癌細(xì)胞SCC15 常規(guī)復(fù)蘇，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染接種SCC15 細(xì)胞于6 孔板中；以Lipofectamine 2000 為轉(zhuǎn)染試劑分別用陰性對照、miR-26b 模擬物和miR-26b 抑制物對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并據(jù)此把細(xì)胞分為NC 組、過表達(dá)組、抑制組。8 h 后培養(yǎng)液更換為含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 行后續(xù)實驗。

1.4 RNA 提取和real-time PCR按試劑盒操作說明提取SCC15 細(xì)胞、目標(biāo)患者口腔癌組織及癌旁正常組織的總RNA，Real-time PCR 檢測樣本miR-26b 表達(dá)水平。癌組織miR-26b 表達(dá)以癌旁正常組織miR-26b 為對照，結(jié)果用2-（Ct 肝癌細(xì)胞—Ct 癌旁正常組織）方式表示。SCC15 細(xì)胞以U6為內(nèi)參，結(jié)果用2-［過表達(dá)組/抑制組Ct（miR-26b-U6）- 對照組Ct（miR-26b-U6）］表示以觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果；繼而以GAPDH 為內(nèi)參，檢測Nanog 及OCT4（表1）的表達(dá)，結(jié)果以2-△△Ct表示。

表1 Real-time PCR 檢測引物Tab.1 Real-time PCR detection primers

1.5 體外成球?qū)嶒灍o血清培養(yǎng)基內(nèi)添加2%B27、20 ng/mL 表皮生長因子、20 ng/mL 成纖維細(xì)胞生長因子、1%的甲基纖維素，調(diào)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)液pH約6.8左右。以約2 000個/孔接種SCC15細(xì)胞于6孔板，7 d后計算細(xì)胞球形成效率（直徑＞75 μm的細(xì)胞球個數(shù)/2 000）。

1.6 免疫印跡法以β-actin 為內(nèi)參，檢測E-鈣粘蛋白水平，ImageJ 1.35V 軟件進(jìn)行分析，結(jié)果以E-鈣粘蛋白密度/β-actin 密度表示。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法SPSS 16.0 行統(tǒng)計學(xué)分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較用雙側(cè)t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-26b 表達(dá)在口腔癌組織中下調(diào)見圖1。5例口腔癌患者癌組織中miR-26b的表達(dá)量均＜1，表明患者口腔癌組織miR-26b 表達(dá)均低于癌旁正常組織。

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果過表達(dá)組SCC15 細(xì)胞的miR-26b 表達(dá)量為（22.22±2.70），顯著高于NC 組（P＜0.05），抑制組的表達(dá)量為（0.34±0.07），顯著低于NC 組（P＜0.05）。結(jié)果顯示本次細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果良好。

2.3 miR-26b 對SCC15 細(xì)胞體外成球能力的影響體外成球?qū)嶒?00 倍鏡下觀察結(jié)果見圖2，過表達(dá)組的細(xì)胞成球率明顯低于NC 組（P＜0.05），抑制組的成球率則高于NC 組（P＜0.05）。

圖1 miR-26b 在口腔癌患者癌組織中的表達(dá)Fig.1 The expression of miR-26b in oral cancer patients′cancerous tissue

2.4 miR-26b 對SCC15 細(xì)胞干性基因表達(dá)的影響見圖3。過表達(dá)組Nanog 及OCT4 基因表達(dá)量明顯低于NC 組（P＜0.05），抑制組2個干性基因表達(dá)量則高于NC 組（P＜0.05）。

2.5 miR-26b 對SCC15 細(xì)胞E-鈣粘蛋白水平的影響見圖4。抑制組SCC15 細(xì)胞E-鈣粘蛋白水平低于NC 組（P＜0.05），過表達(dá)組E-鈣粘蛋白水平高于NC 組（P＜0.05）。

圖2 miR-26b 對SCC15 細(xì)胞體外成球能力的影響Fig2 The effect of miR-26b on SCC15 cells in Sphere experiment

圖3 miR-26b 對SCC15 細(xì)胞干性基因表達(dá)的影響Fig3 The effects of miR-26b on stemness gene expression of SCC15 cells

圖4 miR-26b 對SCC15 細(xì)胞E-鈣粘蛋白的影響Fig4 The effect of miR-26b on E-cadherin of SCC15 cells

3 討論

OSCC 占口腔腫瘤的95%及頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的40%，發(fā)展中國家OSCC 高居男性常見腫瘤的第六位及女性的第十位［2］。雖然目前包括手術(shù)、放療、化療等治療手段有了長足發(fā)展，但其高復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率使OSCC 患者的5年存活率仍然偏低［6］。miRNAs 參與調(diào)節(jié)OSCC的發(fā)病及預(yù)后［7］，F(xiàn)UKUMOTO等［5］構(gòu)建了一個針對OSCC的miRNA矩陣對差異表達(dá)的miRNAs 進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)miR-26b缺失可通過調(diào)控跨膜基因TMEM184B 而增強OSCC 癌細(xì)胞的致病力。BAGHAEI等［8］則通過細(xì)胞實驗驗證了過表達(dá)miR-26b 能抑制口腔鱗癌細(xì)胞的遷移、侵襲及增殖。雖然有研究［4］顯示miR-26b可促進(jìn)結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移，但LI等［9］實驗結(jié)果卻顯示miR-26b 能明顯抑制同樣屬于消化道腫瘤的食道癌細(xì)胞的增值，提示miR-26b 可能是一個多能基因，在各種腫瘤中表現(xiàn)出不同功能。而對于OSCC，本研究發(fā)現(xiàn)5例口腔癌患者的癌組織中miR-26b的表達(dá)顯著低于相鄰的正常組織，結(jié)合FUKUMOTO等［5］和BAGHAEI等［8］的研究，miR-26b 對OSCC 是一個抑癌基因。

CSCs 是腫瘤組織或者轉(zhuǎn)移灶中存在的一群具有自我更新能力的細(xì)胞，具有成體干細(xì)胞的功能特征，這種能力被稱之為腫瘤細(xì)胞的“干性”，與腫瘤的復(fù)發(fā)密切正相關(guān)性，也是OSCC 惡化的主要驅(qū)動力之一［10］。miRNAs 可調(diào)控腫瘤干性的獲得［11］，TROMPETER等［12］發(fā)現(xiàn)miR-26b 能加速臍帶血成體干細(xì)胞的分化，LIN等［13］也發(fā)現(xiàn)miR-26b 可下調(diào)上皮卵巢癌細(xì)胞干性基因OCT4 表達(dá)并抑制其遷移，顯示miR-26b 對部分癌細(xì)胞的干性具有抑制作用，但目前未見miR-26b 影響OSCC 干性的報道，因此本研究以經(jīng)典的OSCC 細(xì)胞模型SCC15 為對象，進(jìn)行了初步的探討。成球能力是單個癌細(xì)胞自我更新能力的重要表現(xiàn)，Sphere 實驗是通過觀察癌細(xì)胞的成球能力從而評估腫瘤細(xì)胞干性的重要體外實驗方法［14］，Nanog和OCT4 作為維持干細(xì)胞自我更新和多能性的關(guān)鍵因子，能使終端分化細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期而進(jìn)行增殖活動，是腫瘤細(xì)胞干性獲得的重要分子標(biāo)志物［15］。本次實驗顯示SCC15 細(xì)胞在過表達(dá)miR-26b 后成球能力下降，抑制miR-26b 后成球能力增加；同時miR-26b 能抑制SCC15 細(xì)胞Nanog和OCT4 兩個干性基因的表達(dá)，表明miR-26b 對SCC15 細(xì)胞的腫瘤干性有負(fù)調(diào)節(jié)作用，與本研究的預(yù)期相符。

EMT 能上調(diào)血管生成前因子VEGF-A的表達(dá)誘導(dǎo)腫瘤血管生成的增加，從而增加腫瘤細(xì)胞移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)時啟動和增殖腫瘤的能力，這是CSCs 豐富的一個主要特征，提示EMT的發(fā)生與腫瘤細(xì)胞干性獲得密切相關(guān)［16］。E-鈣粘蛋白主要分布在上皮細(xì)胞，具有抑制轉(zhuǎn)移的作用，OSCC 中E-鈣粘蛋白表達(dá)的下降是其EMT 過度發(fā)生的重要標(biāo)志［17］且與其疾病預(yù)后相關(guān)［18］。本次Western Blot 結(jié)果顯示miR-26b 能正向調(diào)節(jié)SCC15細(xì)胞的E-鈣粘蛋白表達(dá)，因此筆者推測miR-26b可能通過提高OSCC 細(xì)胞E-鈣粘蛋白水平而抑制其EMT的發(fā)生，從而延緩口腔癌細(xì)胞對腫瘤干性的獲得。本研究結(jié)論僅在體外針對一種OSCC 細(xì)胞得到體現(xiàn)，下一步將以修飾miR-26b 表達(dá)的OSCC 細(xì)胞對裸鼠行定植實驗，希望通過體內(nèi)實驗的驗證，繼續(xù)完善本研究結(jié)論。

綜上所述，本研究提示miR-26b 具有抑制口腔癌細(xì)胞SCC15 腫瘤干性的作用，為miR-26b 對OSCC的抑制作用提供了一定的理據(jù)，miR-26b 具有成為OSCC 治療靶點的潛力，為OSCC的根治提供了新的思考方向。