1 875例孕婦產前遺傳學診斷結果與產前診斷指征分析

龍喜貴 覃婷 莫偉英 伍欣 張鵬 田矛

廣西壯族自治區人民醫院產前診斷中心（南寧530021）

產前診斷是預防出生缺陷的主要手段。目前，國內外針對產前診斷中胎兒染色體異常/畸變檢測以G 顯帶核型分析、拷貝數變異（copy number variation，CNV）檢測及快速產前檢測，如熒光定量PCR（QF-PCR）及熒光原位雜交技術（FISH）檢測為主。G 顯帶核型分析是目前產前診斷細胞遺傳學檢測的金標準，但對5～10 Mb 以下的小片段的染色體CNV 缺乏診斷能力。全基因組拷貝數變異檢測（CNV-sequencing，CNV-seq）可檢測染色體非整倍體以及100 kb 以上CNV 導致的疾病，但不能檢測染色體易位及倒位等平衡變異。美國婦產科醫師學會（ACOG）已推薦其可作為胎兒結構異常時診斷評估的一線檢測方法［1］。FISH［2］及QF-PCR［3］通常只作為對胎兒常見染色體（13、18、21、X、Y）的非整倍體快速篩查。本研究通過聯合應用需細胞培養的染色體核型分析及不需細胞培養的高通量測序CNV-seq，探討了1 875例胎兒中不同產前診斷指征、不同取材及不同檢測方法下的染色體異常檢出率及差異，特別比較及討論了兩種方法在診斷染色體嵌合體上的差異及處理原則。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集自2016年1月至2018年8月因不良孕產史、高齡、單基因病攜帶、母血清篩查高風險、母血中胎兒游離DNA 檢測（non-invasive prenatal test，NIPT）高風險、超聲軟指標異常［如胎兒頸部透明帶（nuchal translucency，NT）增厚、鼻骨缺失、腸管回聲增強、側腦室臨界、腎盂輕度分離等］、超聲胎兒結構異常、胎兒生長受限（fetal growth restriction，FGR）、附屬物異常等高危因素作為產前診斷指征，接受侵入性產前診斷取材，取材培養成功的產前診斷標本共1 875例，其中根據不同孕周，分別進行經腹絨毛活檢169例、羊水取材1 435例、臍靜脈取樣271例。

1.2 研究方法羊水穿刺、臍帶血穿刺及絨毛活檢3種取材均在超聲定位引導下進行。染色體核型分析由我院細胞遺傳實驗室完成，取材后進行細胞培養、收獲、制片及G 顯帶核型分析，使用Zeiss AxioImagerZ2 全自動染色體遺傳分析系統（德國），顯微鏡下觀察并計數20個分裂象，分析5個核型，發現異常核型后則加大計數至50～100個細胞；CNV-seq 外送至湖南家輝遺傳專科醫院，使用Illumina NEXT SEQ CN500 高通量測序儀（中國），通過二代測序法檢測。全部結果經匯總產前診斷指征、超聲結果、染色體核型及CNV 結果等信息進行分析。染色體核型分析根據人類細胞遺傳學國際命名體系（ISCN2016）進行命名，CNV 致病性判讀根據美國醫學遺傳學與基因組學學會（ACMG）診斷標準進行。侵入性產前診斷取材，送檢檢測方法均遵守廣西壯族自治區人民醫院醫學倫理學委員會的要求，所有孕婦術前常規進行咨詢并簽署知情同意書，結果出具后復診及咨詢。

2 結果

2.1 染色體及CNV 異常檢出率1 875例接受產前診斷的孕婦中，總共確診致病性染色體和致病性CNV 179例，異常檢出率9.55%。其中單獨致病性染色體檢出159例，異常檢出率8.48%（159/1 875）。檢出染色體多態88例（4.69%），染色體平衡易位10例（0.53%）；單獨致病性CNV 檢出144例，異常檢出率7.68%（144/1 875）。同時，檢出意義不明CNV 82例（4.37%），多態性CNV 89例（4.75%）。見表1。

表1 1 875例產前診斷胎兒染色體及CNV 異常與多態檢出率Tab.1 The detection rates of chromosome and CNV abnormalities and polymorphisms in 1 875 prenatal diagnosis fetuses

2.2 各高危指征異常檢出率各指征中，NIPT 高危、胎兒心臟異常、胎兒NT 增厚和鼻骨缺失的異常檢出率較高，分別為10.71%（3/28）、41.57%（37/89）、19.72%（14/71）、26.89%（32/119）及15.38%（6/39）。此外，高齡、單臍動脈、羊水異常及IVFET 術后異常檢出率分別為7.69%（64/832）、13.04%（6/46）、7.89%（3/38）及8.22%（6/73）。見表2。

2.3 染色體正常核型及多態性核型中不同CNV的檢出情況90例染色體多態性核型的胎兒中，CNV-seq 發現2例致病性（2.22%）及8例臨床意義不明CNV（8.89%）；1 624例染色體核型正常的胎兒中，CNV-seq 檢出16例致病性CNV（0.99%）及74例臨床意義不明CNV（4.56%）。見表3。

2.4 兩種檢測方法對染色體嵌合的檢出情況共檢出異常染色體嵌合狀況16例，其中2例染色體核型分析正常，但CNV 檢測發現1例為18 三體嵌合，1例為X 染色體單體嵌合，嵌合比例約占1/3；2例CNV 檢測未見異常，但染色體核型發現X 單體嵌合。其余12例嵌合情況一致，但嵌合比例存在差異。見表4。

2.5 染色體三體及性染色體異常核型檢測率3種取材染色體核型分析及CNV-seq 共檢出常見染色體三體/及性染色體異常127例，包括6例13-三體、28例18-三體、51例21-三體、12例45，X、6例47，XXX、7例47，XXY 及4例47，XYY等，檢出率為6.77%（127/1 875）。見表5。

表2 各高危指征及異常檢出率Tab.2 The detection rates of high-risk indications

表3 正常及多態染色體核型中不同CNV的檢出情況Tab.3 The detection of different CNVs in normal and polymorphic karyotypes 例（%）

3 討論

產前診斷是防控出生缺陷的有力舉措。通常，除部分明顯的胎兒畸形或結構異常可通過超聲等得以診斷外，大部分需通過侵入性取材進行產前診斷以避免缺陷患兒出生。本研究回顧性分析了1875例有產前診斷指征的孕婦在超聲引導下，根據孕婦情況及孕周分別選擇絨毛活檢、羊膜腔穿刺或臍帶血穿刺，取材后行胎兒染色體核型分析和/或CNV-seq 檢測，比較了不同指征的胎兒染色體異常檢出率。

與傳統的細胞遺傳學分析相比，超聲檢查發現胎兒畸形的情況下行CNV 檢測可提高致病性CNV 或臨床意義不明CNV的檢出水平［1，4］。在一項針對1 033例超聲提示胎兒畸形的研究中，致病性CNV的檢出率為5.5%［5］。本研究中，總的異常檢出率9.55%。其中單獨染色體核型異常檢出率為8.48%，單獨致病性CNV 異常檢出率為7.68%。減去染色體核型分析能發現的異常外，CNV-seq 可額外發現約1.07%的異常（微缺失、微重復），與報道類似［6］，說明染色體核型分析聯合CNV-seq技術一定程度上提高了異常檢出率，可為遺傳咨詢及再發風險評估提供更多的依據。但需進行檢測前咨詢或產前診斷前咨詢，從而使患者有機會了解CNV檢測技術的益處及局限性，并根據他們的個人信仰和實際情況做出是否進行檢測的決策［7-8］。本研究中常見的指征是高齡，占總穿刺人數的44.37%，可能與目前生育年齡整體偏晚及“二孩”政策開放有關，異常檢出率為7.69%，與國內研究［9］結論相近。其次為不良孕產史和母血清學篩查高危等，這可能與生育觀念改變及血清學篩查的常規應用有關。

表4 染色體核型嵌合檢出情況Tab.4 The detection of chromosome mosaics

表5 染色體三體及性染色體異常核型檢出率Tab.5 The detection rates of autosomal trisomy and sex chromosome anomalies

NIPT 因常見染色體非整倍體近100%的敏感性和特異性使其成為快速應用的基因檢測之一。本研究中，NIPT 總體高危的染色體異常檢出率最高，說明了NIPT技術的陽性預測值較高，展示了NIPT 良好的應用前景。但尚有不少比例為假陽性，這與我們分析統計時將NIPT 提示性染色體異常及相關附加提示（其他染色體或CNV 異常）都包括在內有關，這提示我們NIPT 高危后進一步行產前診斷的必要性。最近一項針對2 779個胎兒的研究發現，報告異常的CNV 結果中約有50%無法通過標準NIPT 檢測到（即不涉及21、18、13-三體，X 單體或性染色體三體）［10］。造成NIPT 結果不一致的原因眾多，限制性胎盤嵌合體、母體CNV、雙胎之一消失、母體癌癥及真正的胎兒嵌合等是最常見的原因［11］。NT 增厚與染色體核型異常、胎兒先天性心臟病及其他結構畸形高度相關，當NT 厚度≥3.0 mm，胎兒致病性CNV 檢出率可達7.69%［12］。本研究中NT 增厚的異常檢出率為26.89%，異常檢出率較高，可能與樣本數較少及計算時包括了染色體異常有關。ACMG 對CNV 評估及臨床解讀是根據CNV 是否相鄰或位于已知綜合征區域，CNV 涉及區域內的基因及其突變的性質與大小等進行。根據此CNV的判讀原則，本研究在1 714例染色體多態或正常的孕婦中檢出18例致病性CNV，說明CNV-seq技術具有更高的靈敏度和特異性。有研究認為年齡小于36歲的孕婦患致病性CNV的風險高于唐氏綜合征［13］。這說明不管高齡與否，常規開展CNV-seq 檢測具有必要性。本研究意義不明CNV 檢出率較高，可能本研究中樣本來源皆為具有產前診斷指征的高危孕婦有關。檢測中發現的臨床意義不明CNV 因報道的變異與表型之間的相關性或證據不足，無法有效將變異與胎兒的異常表型進行關聯。這些臨床意義不明CNV 給臨床診斷及遺傳咨詢帶來了不小壓力。對于新發的臨床意義不明CNV，ACMG 建議對患者出生后進行隨訪［14］。

研究表明［15］胚胎分裂期嵌合率約為15%～90%。相對于常規核型分析，CNV-seq 不需要細胞培養，對分裂期及未分裂期細胞均可檢測。本研究發現16例染色體嵌合體異常，其中2例染色體核型檢測正常，但CNV 檢測發現1例為18-三體嵌合，1例為X 染色體單體嵌合，可能與核型細胞培養過程中，正常細胞相對異常細胞具有生長優勢，經過培養后嵌合情況往往會降低不容易被檢出有關，同時，發現2例CNV-seq 檢測未見異常，但染色體核型分析發現為X 單體嵌合，這可能與離體培養時異常細胞得到擴增或母體細胞污染有關。其余12例嵌合情況一致，但嵌合比例存在差異。這提示因不同方法靈敏度及是否經過培養等差異，檢測的嵌合比例不可避免存在差異。通常，CNV-seq技術對嵌合體的診斷相對于核型分析具有更高的準確性和真實性，這提示筆者在遇到產前診斷嵌合的情況時，需結合超聲及多個平臺的結果進行綜合評價，并建立特殊病例討論制度。做到“準確”診斷，有效咨詢。21、18、13-三體及性染色體非整倍體是導致出生缺陷的常見原因。本研究中，三種取材共檢出常見染色體三體/及性染色體異常127例，檢出率為6.77%。21、18、13-三體總計85例，以21-三體最多，占60%。這提示我們對常見三體綜合征及性染色體異常的產前診斷工作依然是重點，需謹慎全面，診斷有力有效。

綜上所述，本研究通過聯合應用染色體核型分析及CNV-seq技術，較為詳細地闡述了不同指標及不同方法下異常染色體的檢出率，特別分析了兩種方法對染色體嵌合體的檢出比例差異，有效改善了產前診斷的準確性，阻斷了異常胎兒的出生。但檢出的眾多臨床意義不明CNV 使得產前診斷的臨床咨詢更具復雜性及挑戰性。本研究的不足在于樣本量偏小，部分指標的分析易受樣本量的影響。隨著進一步診斷及研究，樣本量增大后這一問題將得到解決。鑒于染色體平衡易位通常不產生病理表型，是否平衡易位核型胎兒不需要進行產前診斷選擇？在常規染色體核型分析不能診斷平衡易位產生的斷裂或融合致病基因的前提下，G 顯帶核型分析是否逐漸失去了檢測的意義？是否可完全被CNV 檢測取代？隨著技術的不斷發展終將得到解決。