血清25-OH-VD、Hcy和免疫細胞水平與卵巢反應性的研究

郭 楠，吳 莉

卵巢低反應是指在控制性超促排卵(controlled ovarian hyperstimulation, COH)過程中卵巢對促性腺激素(gonadotropins, Gn)反應過低甚至無反應，導致獲卵數少、周期取消率高以及臨床妊娠率降低。卵巢低反應會在一定程度上危害患者的生殖健康，已經成為輔助生殖技術領域中最具挑戰性的難題之一。卵巢低反應受多種因素影響，除了年齡以外，通常認為卵巢反應性的好壞主要取決于卵巢儲備情況[1]。而越來越多的臨床研究發現，相當一部分年輕、卵巢儲備功能良好的婦女也會發生低反應。近年來，部分研究認為卵巢反應與體內的免疫微態有關，而25-羥基維生素D(25-OH-VD)、同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)、免疫細胞亞群(T細胞、B細胞、NK細胞)均是參與機體免疫的重要指標。該研究旨在探討卵巢反應性與25-OH-VD、Hcy及T細胞、B細胞、NK細胞的關系，為臨床上對于卵巢低反應的診斷和治療提供可靠的參考依據。

1 材料與方法

1.1 基礎資料選取2017年9月～2018年2月在安徽省立醫院生殖醫學中心體外受精/卵胞漿內單精子注射-胚胎移植(invitrofertilization or intracytoplasmic sperm injection-embryo transfer,IVF/ICSI-ET)治療的179例患者作為觀察對象，根據獲卵數目分為2組，其中將獲卵數≤3個的61例患者作為卵巢低反應組，將獲卵數在4～18個的118例患者作為正常反應組[2]。兩組患者的年齡、不孕年限、體質量指數(body mass index,BMI)、竇卵泡數(antral follicle count,AFC)、基礎促卵泡生長激素(basic follicle-stimulating hormon,bFSH)、基礎黃體生成素(basic luteinizing hormone,bLH)、基礎雌二醇(basic estradiol,bE2)等指標比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 兩組患者的臨床基礎資料比較

1.2 納入與排除標準

1.2.1納入標準 年齡≤35歲；卵巢儲備功能正常；單純因輸卵管因素或男方因素行IVF-ET/ICSI-ET者；本人或家屬知情并簽署同意書。

1.2.2排除標準 既往多囊卵巢綜合征；存在卵巢反應不良高危因素者；合并子宮內膜異位癥或其他內分泌疾病；既往不良妊娠史；中途退出研究者。

1.3 方法

1.3.1控制性超促排卵 全部入組研究對象均采用經典黃體期降調節長方案，方法如下：月經周期第2～4天開始口服避孕藥(炔雌醇環丙孕酮片，商品名達英-35，拜耳醫藥保健有限公司廣州分公司)1片/次，每天1次，口服用藥21 d，在服用第14～17天時采用超聲檢查有無大卵泡，如無大卵泡，即日開始皮下注射促性腺激素釋放激素激動劑醋酸亮丙瑞林微球(批準文號：國藥準字H20093852；生產單位：上海麗珠制藥有限公司；藥品規格：3.75 mg)，根據患者BMI值，調整降調藥物劑量1.250～1.875 mg，待14 d后抽血檢測促卵泡生長激素(follicle-stimulating hormon,FSH)、黃體生成素(luteinizing hormone,LH)、雌二醇(estradiol,E2)同時陰道超聲檢查卵泡情況，適時加用促性腺激素(批準文號：國藥準字H20052130；生產單位：麗珠集團麗珠制藥廠；藥品規格：以尿促卵泡素效價計75 IU)150～300 IU，當至少有一個卵泡直徑達18 mm以上或至少有兩個卵泡直徑達17 mm時，注射重組人絨促性腺素(注冊證號：S20110045；生產單位：Merck Serono Europe Limited；藥品規格：250 μg)250 μg。36 h后在超聲引導下經陰道穿刺取卵。

1.3.2標本收集 ① 在IVF治療前一個月經周期第2～5天清晨留取患者空腹靜脈血5 ml，用來檢測FSH、LH、E2、25-OH-VD、Hcy等指標；② 在GnRHa降調節后14 d，再次空腹來院留取靜脈血3 ml，檢測FSH、LH、E2等指標；③ 注射重組人絨促性腺素日抽取空腹靜脈血3 ml，檢測免疫細胞亞群。

1.3.3標本檢測 ① 采用免疫化學發光法檢測FSH、LH、E2水平，ACCESS全自動微粒子化學發光免疫分析系統購自美國Beckman公司；② 采用ELISA法檢測Hcy水平，試劑盒及相關配套檢測試劑均購自北京百奧萊博科技有限公司；③ 采用ELISA法檢測25-OH-VD水平，試劑盒及相關配套檢測試劑均購自美國R&D公司；④ 采用FACSCalibur 流式細胞儀檢測T、B、NK細胞亞群，流式細胞儀及相關的配套檢測設備均購自美國BD公司。全部數據均取平均值，剔除異常數據。

2 結果

2.1 兩組患者的降調結果比較兩組患者降調后的FSH、LH、E2、子宮內膜厚度、竇卵泡直徑比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

2.2 兩組的促排天數、促排用量、Hcy、25-OH-VD表達水平比較卵巢低反應組中Hcy水平均高于正常反應組，差異有統計學意義(P<0.05)，但兩組的促排天數、促排用量、25-OH-VD水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表2 兩組患者的降調結果比較

表3 兩組患者的Hcy、25-OH-VD水平、促排天數比較

2.3 兩組患者免疫細胞亞群表達情況比較卵巢低反應組中T細胞、Th細胞水平均稍高于正常反應組，但差異無統計學意義(P>0.05)，NK細胞比例顯著高于正常反應組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 兩組患者的免疫細胞亞群表達情況比較

3 討論

3.1 卵巢激素、子宮內膜厚度、竇卵泡直徑的檢測意義COH是體外受精胚胎移植技術的重要組成部分，該療法可增加在同一周期的卵泡募集，避免機體內在的選擇單個卵泡的機制以及主導卵泡對其他卵泡生長發育的抑制作用，從而使多個卵泡同步生長發育并達到成熟，提高同一周期的獲卵數，進而提高妊娠率。由于不同患者的卵巢對Gn的敏感度不同，因此藥物的療效存在一定的差異性。臨床上準確預測卵巢反應性，有助于降低周期取消率及減少相關醫源性并發癥，但卵巢高反應的高低目前尚無統一標準，其中FSH、LH、E2、子宮內膜厚度、竇卵泡直徑等指標均是預測卵巢反應性的重要指標，而本研究中兩組患者降調后的FSH、LH、E2、子宮內膜厚度、竇卵泡直徑比較，差異無統計學意義(P>0.05)，導致上述結果可能與患者的年齡有關，國內學者李麗娟 等[3]的臨床研究中證實，年齡超過35歲患者中血FSH、LH等指標對卵巢低反應有較好預測價值，而在年齡低于35歲患者中則無預測價值。

3.2 25-OH-VD、Hcy與卵巢反應性

3.2.125-OH-VD與卵巢反應性 近年來，隨著生殖領域研究的不斷深入，維生素D在生殖領域中引起了越來越廣泛的關注。國外的一項研究指出維生素D可參與鈣磷代謝、機體免疫及生殖等生理過程，是生殖過程中的一個關鍵因素[4]。25-OH-VD是維生素D在機體內的主要循環形態，主要是由維生素D在肝臟中通過羥基化作用轉化而來，是目前公認的能夠客觀評價維生素D營養狀況的最佳指標。維生素D參與生殖過程可能與以下幾方面因素有關：25-OH-VD可在腎臟中轉化為具有活性的1,25(OH)2D3，卵巢是1,25(OH)2D3的靶器官，因此維生素D3活性代謝產物可能在調節卵巢活動中發揮重要作用；另有文獻[5]報道，人抗穆勒管激素(AMH)基因啟動子區存在一種功能性的維生素D反應素，直接影響AMH的表達，而1,25(OH)2D3可改變顆粒細胞對AMH的敏感性，促進顆粒細胞的分化與發育。這一理論與Irani et al[6]提出的維生素D可以下調AMH基因的表達，上調促卵泡激素受體基因的表達相符。結果提示維生素D水平可能影響著卵泡發育和卵巢的反應性。同時有研究[7]結果表明，白種人維生素D水平和IVF結局呈正相關，然而在亞洲人群中并未觀察到這種現象。本結果也顯示25-OH-VD水平在卵巢低反應組與正常反應組無顯著差異。

3.2.2Hcy與卵巢反應性 Hcy是蛋氨酸和半胱氨酸代謝過程中的重要中間產物，近些年國內外一些研究[8]表明，體內Hcy水平升高會對男性和女性的生育力產生一定的影響。本研究結果顯示，卵巢低反應組中Hcy水平均高于正常反應組，差異有統計學意義(P<0.05)，提示Hcy可能與卵巢低反應有關。Hcy對卵巢低反應的影響機制目前尚不十分明確，但大量的研究[9-10]顯示基因的多態性可能會影響Hcy的表達，而Hcy的高表達可能通過減少細胞分裂、產生相關的炎性細胞因子而導致卵泡發育、胚胎發育、激素分泌等生殖功能受損。

3.3 T細胞、B細胞、NK細胞與卵巢反應性在IVF周期中，為了募集到更多的卵泡而使用大量的外源性Gn，會引起雌二醇及其他激素處于高生理水平狀態，免疫微環境也隨之改變。一般認為Gn刺激可改變卵泡液中免疫細胞形態及卵泡液和外周血中免疫細胞比例，改變患者機體內的免疫狀態。研究[11-12]顯示μNK細胞可分泌血管內皮生長因子、趨化因子-10、白細胞介素-8、基質細胞衍生因子-1等多種促血管生成因子，調節血管發生。血管發生的調節在女性生殖生理中扮演著重要的角色，可影響卵泡的生長、優勢卵泡及黃體的形成、子宮內膜的分化及胚胎的植入等重要的生理過程，是誘發卵巢低反應的高危因素。Jimmy et al[13]的相關臨床研究中顯示，在卵巢血流顯示欠佳的患者中，至少36%的患者表現出了卵巢低反應，僅有16%的患者表現為正常的卵巢反應。另有研究[14]證實，在反復種植失敗的患者中外周血pNK細胞比例增加，pNK呈活化狀態，細胞毒性增強。本研究中，兩組T細胞與B細胞比例間存在差異但無統計學意義，而NK細胞比例的差異，具有統計學意義(P<0.05)，推測NK細胞或許可通過調控卵巢周圍血管的生成及改變卵巢周圍的免疫微環境，通過產生細胞毒性來影響卵巢反應，造成卵巢反應不良。

綜上所述，Hcy、NK細胞與卵巢反應性存在密切的相關性，二者的高表達或可引起卵巢低反應，進而影響生殖健康。當然本研究也存在一定的局限性，由于研究時間有限，加上卵巢低反應組內患者的病例數較少，因此試驗結果可能存在一定偏差，今后逐步完善試驗方案，擴大試驗規模，進一步探討血清25-OH-VD、Hcy和免疫細胞水平與卵巢反應性的相關性，為臨床治療提供參考依據。