2，4-表油菜素內(nèi)酯緩解水稻花期高溫脅迫的生理機(jī)制

高健 王亞梁 孫磊 趙淵 劉連盟 侯雨萱 王玲黃世文

（中國水稻研究所/水稻生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州310006；*通訊作者：wangling03＠caas.cn；huangshiwen＠caas.cn）

自從工業(yè)革命以后，CO2排放量增加，地表溫度不斷上升。IPPC（2013）報(bào)告指出，在100多年來，全球地表平均溫度升高了0.85℃，預(yù)計(jì)未來100年左右，溫度大約會(huì)再提高0.3℃～4.8℃[1]。據(jù)估計(jì)到21世紀(jì)末，溫度上升可能使我國水稻的產(chǎn)量降低41%[2]。長江中下游地區(qū)是我國主要的水稻種植區(qū)域，該地區(qū)水稻受到高溫的影響非常明顯。有研究表明，2017年合肥市水稻開花期在7月22日至28日期間遇到38℃以上的高溫，導(dǎo)致部分水稻品種的結(jié)實(shí)率下降15%～25%[3]。在水稻的生育期中，花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂期和開花期對(duì)高溫脅迫最敏感，在這兩個(gè)時(shí)期內(nèi)遭遇高溫，會(huì)導(dǎo)致水稻產(chǎn)量顯著下降[4-5]。

目前，培育耐熱型水稻品種是抵御高溫最重要的方法，耐熱品種受高溫脅迫傷害較小，易形成大穗，結(jié)實(shí)率高[6]。同時(shí)，調(diào)整栽培措施也是一種重要的農(nóng)藝措施。比如，分期播種錯(cuò)開水稻花期高溫，或者高溫逆境時(shí)進(jìn)行深水灌溉[6-7]。但是耐熱型水稻品種少，培育耐熱型水稻品種時(shí)間緩慢，而調(diào)整栽培措施也會(huì)產(chǎn)生一些問題，比如，調(diào)整播期能夠避開高溫，但避開高溫的同時(shí)可能增大病蟲害發(fā)生的可能，因此，噴施化學(xué)調(diào)控劑不失為一種有效的方法[8-9]。已報(bào)告能減輕植物高溫傷害的化學(xué)調(diào)節(jié)劑有激素類、滲透壓調(diào)節(jié)劑、抗氧化劑、信號(hào)分子、多胺和微量元素等[10]。與其他類型的化學(xué)調(diào)節(jié)劑相比，激素類在植物抗逆方面的作用更為明顯。已有研究表明，噴施水楊酸、茉莉酸甲酯等植物激素可通過提高植物的抗氧化酶活性、光合作用以及可溶性糖含量等來避免或減輕作物受到高溫傷害[6，11]。

油菜素內(nèi)酯（Brassinosteroids，BRs）是多羥基化類固醇類植物激素，能影響植物對(duì)外界信號(hào)的反應(yīng)，在植物生長發(fā)育方面有著重要作用。BRs不僅能影響植株大小、雄性生育力、開花和光合作用等[12-13]，而且可能會(huì)增加各種生物和非生物逆境的適應(yīng)性[12，14]，被認(rèn)為是“輔助植物修復(fù)”的潛在激素。2，4-表油菜素內(nèi)酯（EBR）是BRs的一種，在減輕植物高溫脅迫方面有著優(yōu)良的效果。謝云燦等[13]研究表明，噴施EBR不僅能改善大豆品質(zhì)，還能減輕大豆高溫脅迫下的傷害，提高產(chǎn)量。張永平等[15]研究表明，EBR有利于高溫脅迫下甜瓜幼苗抗氧化酶活性的提高和對(duì)光能的捕獲與轉(zhuǎn)換，對(duì)甜瓜幼苗的生長有利。BRs在其他作物耐熱性方面的研究已有一定的報(bào)道，但是在緩解水稻高溫逆境方面的研究甚少。本研究以耐熱型水稻品種黃華占為試驗(yàn)材料，探究2，4-表油菜素內(nèi)酯緩解水稻高溫?zé)岷Φ淖饔脵C(jī)制，為化學(xué)調(diào)控減輕水稻高溫傷害提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 參試材料

供試水稻品種為耐熱型品種黃華占[16]。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在水稻破口期，將盤栽苗移入人工氣候箱進(jìn)行高溫脅迫處理。高溫處理為：0∶00-7∶00，31℃；7∶00-9∶00，32.5℃；9∶00-14∶00，38℃；14∶00-16∶00，36.5℃；16∶00-24∶00，31℃。常溫對(duì)照處理為：0∶00-7∶00，25℃；7∶00-9∶00，26.5℃；9∶00-14∶00，32℃；14∶00-16∶00，30.5℃；16∶00-24∶00，25℃。人工氣候箱中的相對(duì)濕度控制在75%左右。高溫處理5 d后，將水稻植株移置自然環(huán)境下。

本試驗(yàn)共設(shè)4個(gè)處理：NT-CK，常溫噴施清水；NT-EBR，常溫噴施 0.55 mg/mL 的 EBR；HT-CK，高溫脅迫下噴施清水；HT-EBR，高溫脅迫下噴施0.55 mg/mL的EBR。在水稻花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中后期進(jìn)行藥劑噴施處理，每隔3 d噴1次，共噴施3次，每次噴到藥液在葉片自然滑落為止。每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 花粉表型觀察和產(chǎn)量因素

于高溫處理后第3 d，從每穗上、中、下部位各取3個(gè)穎花，用1%I2-KI溶液染色在熒光顯微鏡下（OLYMPUS，BX61）觀察花粉活力，取所有當(dāng)天開花的穎花在體式顯微鏡下（OLYMPUS，SZX9）觀察花藥破裂率，計(jì)算花粉育性和花藥破裂率[花粉活力（%）=染色花粉粒數(shù)/花粉粒總數(shù)×100；花藥破裂率（%）=（待測(cè)花藥數(shù)-未破裂花藥數(shù)）/待測(cè)花藥數(shù)×100]。每個(gè)處理3次重復(fù)。于水稻成熟后，收取20個(gè)穗子，考查千粒重、每穗總粒數(shù)和實(shí)粒數(shù)。每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.3.2 相關(guān)生理指標(biāo)

高溫處理第3 d，取新鮮穎花用于生理指標(biāo)的測(cè)定。超氧化物歧化酶（SOD）活性測(cè)定采用Giannopolitis和Ries的方法[17]；POD活性測(cè)定采用Maehly和Chance的方法[18]；CAT活性測(cè)定采用李仕飛等的方法[19]；丙二醛含量的測(cè)定采用Dhindsa等方法[20]；脯氨酸含量的測(cè)定采用張殿忠的方法[21]；可溶性糖含量的測(cè)定用蒽酮比色法[22]。

1.3.3 內(nèi)源激素含量

高溫處理3 d后，采用符冠富等的方法[7]測(cè)定內(nèi)源激素含量。稱取0.1 g穎花鮮樣，加4℃放置的1 mL提取液（80%甲醇中含有1 mmol/L二叔丁基甲苯酚），冰上勻漿后，4℃提取4 h，4℃ 10 000 r/min離心10 min，定容5 mL，安捷倫C18SPE處理后氮吹，用樣品稀釋液溶解，采用酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA）測(cè)定ABA和GA含量。

1.3.4 ABA合成相關(guān)基因OsNECD2的表達(dá)分析

高溫處理3 d后，取穎花鮮樣，用常規(guī)TRIGOL法提取RNA。cDNA的合成用TaKaRa的實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTM RT Master Mix），使用Applied Biosystems公司的ABI7900進(jìn)行相關(guān)基因表達(dá)量的測(cè)定。PT-PCR運(yùn)行程序：預(yù)變性95℃ 1.5 min；95℃ 10s，60℃ 30 s，72℃ 20 s，40 個(gè)循環(huán)。采用 2-△△CT進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算。OsNECD2的上游引物序列5’-AGCACAGAGGATTGCACCATT-3’，下游引物序列 5’-TGTTGTCTCCAAGCCTTGATTT-3’；內(nèi)參基因ubi的上游引物序列 5’-GCTCCGTGGCGGTATCAT-3’，下游引物序列 5’-CGGCAGTTGACAGCCCTAG-3’。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用 Microsoft Excel 2010和SAS 9.2進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)和分析，用Duncan’s法檢驗(yàn)處理間差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 噴施EBR對(duì)產(chǎn)量構(gòu)成因素的影響

從表1可見，與常溫對(duì)照相比，高溫脅迫后水稻結(jié)實(shí)率降低42.79%，而對(duì)每穗總粒數(shù)、千粒重沒有顯著影響；在常溫下，噴施EBR對(duì)結(jié)實(shí)率、穗總粒數(shù)以及千粒重均無顯著影響。高溫脅迫下，噴施EBR相對(duì)噴施清水使水稻結(jié)實(shí)率提高了24.09%，而噴施EBR對(duì)穗總粒數(shù)和千粒重?zé)o顯著影響。

2.2 噴施EBR對(duì)花粉活力以及花藥開裂的影響

花粉活力和花藥開裂率是影響水稻結(jié)實(shí)的重要因素。各個(gè)處理下的花粉活力以及花藥開裂率的調(diào)查表明，與常溫對(duì)照相比，高溫脅迫后水稻花藥開裂率降低36.87%，穗子中、下部位的花粉活力分別降低8.38%和21.1%；在常溫下，噴施EBR對(duì)花粉活力和花藥開裂并無顯著影響。在高溫脅迫下，噴施EBR相對(duì)噴施清水，花藥開裂率提高55.4%，穗子中部和下部的花粉活力分別提高了8.64%和24.2%（表1）。

2.3 對(duì)抗氧化酶的影響

SOD、POD、CAT能清除植物體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧（ROS），防止膜脂質(zhì)過氧化。測(cè)定結(jié)果表明，與常溫對(duì)照相比，在高溫脅迫下SOD、POD、CAT的酶活性分別上升了29.83%、101.37%和91.73%，常溫下噴施EBR后SOD的酶活性提高了51.76%，對(duì)POD和CAT無顯著影響。高溫脅迫下，噴施EBR相對(duì)噴施清水SOD、POD酶活性分別上升了20.4%和30.9%，對(duì)CAT無顯著影響（表2）。

表1高溫脅迫下EBR對(duì)水稻產(chǎn)量及花粉育性的影響

表2高溫脅迫下EBR對(duì)水稻生理指標(biāo)的影響

2.4 對(duì)丙二醛含量的影響

MDA是評(píng)價(jià)脂膜受損程度的指標(biāo)之一。測(cè)定結(jié)果表明，與常溫對(duì)照相比，高溫脅迫下MDA含量顯著上升54.77%，常溫下噴施EBR MDA降低了36.23%；高溫脅迫下噴施EBR相對(duì)噴施清水MDA下降了25.14%（表 2）。

2.5 對(duì)可溶性糖和脯氨酸含量的影響

可溶性糖和脯氨酸的積累有助于保持細(xì)胞滲透平衡。測(cè)定結(jié)果表明，與常溫對(duì)照相比，高溫脅迫下可溶性糖和脯氨酸的含量顯著上升了46.23%和45.13%，常溫下噴施EBR后可溶性糖和脯氨酸含量升高了41.34%和38.57%；而高溫脅迫下噴施EBR后可溶性糖和脯氨酸含量分別提高8.23%和11.02%（表2）。

2.6 對(duì)GA和ABA含量的影響

植物激素間的相互作用可以調(diào)控植物的生長發(fā)育。測(cè)定結(jié)果表明，與常溫對(duì)照相比，高溫脅迫下GA含量下降12.54%，ABA含量上升39.25%，常溫下噴施EBR后GA含量下降20.69%，ABA含量上升了32.27%；高溫脅迫下，噴施EBR后GA含量下降18.81%，ABA含量上升7.48%（表2）。

2.7 對(duì)ABA合成基因OsNCED2表達(dá)量的影響

OsNCED2是控制ABA的合成代謝途徑的關(guān)鍵基因。基因表達(dá)量分析表明，與常溫對(duì)照相比，高溫脅迫下，OsNCED2表達(dá)量上升305.16%，常溫下噴施EBR后OsNCED2表達(dá)量上升了181.58%；高溫脅迫下，噴施EBR后OsNCED2表達(dá)量上升30.67%（表2）。

3 討論

花粉的萌發(fā)、授粉、花藥開裂等生理活動(dòng)易受到高溫影響，從而導(dǎo)致水稻的敗育，結(jié)實(shí)率下降，產(chǎn)量降低。高溫脅迫下，穎花觀察是高溫指標(biāo)中的重要因素。張桂蓮等[23]的研究發(fā)現(xiàn)，在高溫脅迫下，水稻花藥開裂受到抑制，花粉粒數(shù)減少，花粉活性降低，導(dǎo)致小穗育性降低，結(jié)實(shí)率下降，這與本研究的結(jié)果一致。在本研究中，常溫下噴施EBR對(duì)花粉活力、花藥開裂無顯著影響，而高溫脅迫下噴施EBR能使水稻花藥和穗子中、下部位的花粉的活性提高，有利于水稻結(jié)實(shí)，這說明高溫脅迫下花粉育性的提高是由于噴施了EBR的緣故，EBR有助于維持水稻本身的抗逆性。

高溫脅迫會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)的活性氧（ROS）的過量產(chǎn)生[24]，如超氧自由基（O2-）、羥基自由基（OH）和過氧化氫（H2O2）等，導(dǎo)致膜脂質(zhì)過氧化，蛋白質(zhì)變性和核酸損傷[25]。為了阻止高溫脅迫下ROS對(duì)細(xì)胞的損害，植物中的一系列的抗氧化活性酶，包括SOD、、POD、CAT、APX，以及AsA和GSH等非酶系統(tǒng)的活性上升，可能有效的清除ROS，防止膜脂質(zhì)過氧化，減輕高溫傷害[26-27]。在本研究中，噴施EBR誘導(dǎo)了水稻SOD和POD的酶活性增加，有助減輕高溫下ROS積累帶來的損傷。然而，尚不清楚EBR是否直接或間接調(diào)節(jié)植物對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)[28]。

在脅迫條件下的植物已經(jīng)進(jìn)化出在胞質(zhì)溶膠中積累相容的滲透物用于細(xì)胞內(nèi)維持滲透穩(wěn)態(tài)，這些滲透物包括脯氨酸、可溶性糖以及可溶性蛋白[25]。這些滲透物不僅在滲透調(diào)節(jié)中起作用，其中脯氨酸還能參與氮代謝、能量代謝以及保護(hù)生物大分子，可溶性糖能保持細(xì)胞膜和原生質(zhì)膠體的穩(wěn)定，并為有機(jī)物的合成提供碳架[29]。高溫逆境提高了脯氨酸和可溶性糖含量，EBR處理促進(jìn)了這兩種滲透保護(hù)劑的積累，表明EBR可能會(huì)促進(jìn)滲透物的積累，這可能與這些植物的耐熱性提高密切相關(guān)。

植物激素間的相互作用可以調(diào)控植物的生長發(fā)育，已有眾多研究揭示了BR和其它激素的相互作用[30-31]。GA和BR都是促進(jìn)生長的激素，但是它們之間存在拮抗關(guān)系[32]。有研究表明，在水稻根部，當(dāng)施加過量活性BR時(shí)，該激素主要通過GA失活基因GA2ox-3的上調(diào)誘導(dǎo)GA失活，導(dǎo)致激素水平降低和生長抑制[33]。DELLA家族蛋白，在GA信號(hào)分子中在N端具有DELLA結(jié)構(gòu)域的蛋白。有研究表明，GA含量的降低有利于DELLA的積累，并且DELLA家族蛋白在環(huán)境壓力下能參與植物適應(yīng)性生長[34]。在本研究中，外源EBR的處理使得GA含量降低，這可能是外源EBR使水稻能維持較高抗逆性的原因。ABA可以增強(qiáng)抗氧化酶活性、調(diào)節(jié)光合作用、促進(jìn)細(xì)胞吸水、調(diào)節(jié)氣孔、緩解逆境傷害[35-37]。而高溫處理可以使ABA含量增加[38]，從而調(diào)整植物適應(yīng)高溫脅迫。OSRK1/SAPK6和SAPK4參與ABA信號(hào)傳導(dǎo)，而噴施EBR可能通過影響這些蛋白磷酸化水平來影響ABA信號(hào)傳導(dǎo)[39]。在本研究發(fā)現(xiàn)，噴施EBR GA含量下降，ABA含量上升，這說明EBR能通過內(nèi)源激素的變化來達(dá)到減輕高溫對(duì)水稻的傷害的目的。

9-順-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶（NCED）是水稻和擬南芥ABA生物合成的限速酶，在水稻中存在5個(gè)NCED基因，包括OsNCED1、OsNCED2、OsNCED3、Os-NCED4和OsNCED5，其中僅有OsNCED3基因表達(dá)受干旱脅迫誘導(dǎo)[40]，但是在我們的研究中，高溫可以誘導(dǎo)OsNCED2基因的表達(dá)，噴施EBR進(jìn)一步誘導(dǎo)Os-NCED2的表達(dá)，OsNCED2是否是高溫下ABA的生物合成關(guān)鍵基因以及噴施EBR是否是影響OsNCED2的表達(dá)進(jìn)而提高ABA的含量還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究表明，在高溫脅迫下，噴施EBR能通過提高抗氧化酶的活性、滲透保護(hù)劑的積累，以及內(nèi)源激素的調(diào)節(jié)，來維持花粉育性和花藥的正常，從而減輕高溫對(duì)水稻結(jié)實(shí)的傷害。本研究提供了EBR緩解水稻高溫傷害的技術(shù)支持，對(duì)高溫逆境下水稻的保產(chǎn)措施有著參考作用。