DNA條形碼技術在加工食品鑒定中的應用

牛家樂，費鑫楊，傅寅旭，張 俊，潘迦明，陳 毓，王 旭

(杭州醫學院檢驗醫學院，浙江 杭州 310053)

近年來，食品安全一直都是備受關注的熱門話題。全球各國政府針對大部分市場流通食品都制定、出臺了嚴厲的法律法規，但在經濟利益的驅使下，仍有部分不法分子通過各種手段進行造假摻假[1]。目前，我國食品安全問題主要體現在加工制作環節隱患大，同時批發零售和儲藏等環節也存在問題[2]。在加工食品的制作過程中，高溫滅菌、煎、炸、添加食品添加劑、食品防腐劑等處理不僅會改變原材料的形態、味道和口感，還會造成核基因結構的破壞[3]，這使得加工食品原材料的物種溯源鑒別變得相對困難。因此，迫切需要建立一些有效的檢測方法來識別加工食品的來源，幫助準確地確定食品摻假造假行為。

目前國內和國際加工食品及其來源的鑒定方法有：一種是以傳統的形態學檢測法、顯微法、光譜學、色譜法、質譜法等為代表的理化鑒定方法；二是以ELISA、等點聚焦電泳法、人工免疫凝集技術為代表的傳統生物學鑒定方法[4]；第三種是以PCR技術、AFLP技術、DNA條形碼技術為代表的現代分子檢測技術[5]。相比之下，由于加工后食品的外觀相似，傳統的理化方法具有較高的假陽性率。傳統的生物學鑒定方法也因性價比低、特異性差、靈敏度低等而存在局限性[6]。隨著生物信息學數據庫的不斷更新建立，基于DNA檢測的現代分子檢測技術憑借DNA樣本的穩定性和廣泛性在加工食品的檢測中發揮著相對重要的作用[7]。在各種現代分子生物學檢測技術中，DNA條形碼(DNA barcoding)被認為是一種基于分子生物學手段鑒定生物標本的技術，可以有效地鑒別原材料來源，以及工業食品鏈中出現的摻假現象[8-9]。因此，DNA條形碼技術在加工食品鑒定的實際應用中具有廣闊的前景。

1 DNA條形碼概述

1.1 DNA條形碼定義

DNA條形碼技術最早由加拿大動物分類學家Paul Hebert在2003年提出，其理論依據是使用一段獨立物種的特定DNA序列，對該基因區段設計通用引物，并通過PCR擴增和測序將序列與現有數據庫進行序列比對，確定物種名稱和生物實體之間對應的關系[10]。該方法類似于超市商品由條形掃碼確定，并且利用A、T、G、C四個堿基的基因順序識別物種，每個物種都能找到與其特異對應的DNA條形碼序列。這種基于遺傳信息的DNA條形碼技術對已知和未知物種的鑒定使其在食品檢測等領域發展迅速。

1.2 DNA條形碼的優點

DNA條形碼作為一種在食品鑒定領域具有廣闊應用前景的分子技術，具有以下優勢：(1) DNA序列是物種鑒別的金標準：它基于遺傳信息，不受個體生長發育和外部環境的影響；(2) 公認的國際數據庫信息：2003年，全球50多個國家的研究機構提出國際生命條形碼計劃(International Barcode of Life,IBOL)以實現DNA條形碼用于物種鑒定的全球化標準。2010年，成功建立了昆蟲、魚類和鳥類等動物物種的DNA條形碼數據庫[11-13]，以及入侵生物和害蟲DNA條形碼信息庫(INBIPS)、生命DNA條形碼數據庫(Barcode of Life Database,BLOD)[14]；(3) 通用引物的設計：通過特定分子技術(例如實時熒光定量PCR等)鑒定多個物種通常需要整合幾對或甚至幾十種引物探針，而DNA條形碼只需要一對或幾對引物即可達到預期的效果[15]；(4) 未知物種的發現和鑒別：對發現的未知物種，通過計算遺傳距離、數據庫比對以及構建進化樹，實現物種的識別和定位[16]。

目前，動物DNA的數據庫主要包括生命DNA條形碼數據庫(BOLD)、魚類DNA條形碼數據庫(FBIS)和美國國家生物技術信息中心(NCBI)，用于管理植物DNA的數據庫包括NCBI、歐洲分子生物學實驗室(TMBL)和日本DNA數據庫(DDBJ)，以上系統均以DNA條形碼為通用標準，并提供一個聯機工作臺，用于收集、管理、分析和使用DNA條形碼。其中動物DNA條形碼技術通常使用680 bp的線粒體CO I(Cytochrome C oxidase subunit I,CO I)序列作為靶標[17]，植物DNA條形碼的靶標是國際生命條形碼聯盟植物工作組(Consortium for the Barcode of Life Plant Working Group)在2009年初步確定并推薦使用的葉綠體基因編碼區(rbcL和matK)、間隔區(trnH-psbA)及核基因ITS[18]。隨著DNA數據庫的不斷完善和DNA條形碼技術的不斷發展，國內外的許多專家學者對食品安全領域的摻假問題以及錯貼標簽等問題進行了深入的探究[19]。研究表明，DNA條形碼技術可以避免形態學分類的缺陷，打破傳統標準中PCR檢測目標唯一性的局限，具有更廣闊的應用前景。

2 DNA條形碼技術在加工食品鑒定中的應用

隨著食品全球化的發展和人們日益增長的需求，市場上加工食品數量和種類越來越多，但這也意味著替代類似物種和不受控制地添加外來物種將對消費者的健康構成重大風險。采用常規理化技術或DNA芯片等傳統分子水平的鑒定技術，在加工食品鑒定中受到限制。目前，DNA條形碼技術已廣泛應用于動物、植物和微生物等領域[20-24]。作為一種簡便而精確的鑒定方法，新興的DNA條形碼技術為加工食品的分類鑒定以及標簽的合規性也提供了新的方向，在加工食品檢測中的應用越來越廣泛[25]。

2.1 DNA條形碼技術在畜禽肉制品鑒定中的應用

在人類日常消費中，以家畜、家禽為主的肉及其加工制品的食用占比很高。由于商家對原材料進行了加工，使得消費者無法對肉質進行識別，只有通過技術手段才能進行鑒別，而DNA條形碼技術因其特異性強、檢出率高等優勢而被廣泛使用[26]。鐘文濤等[27]利用DNA條形碼技術對市售的50份牛羊肉制品的動物成分進行了抽查，結果表明，牛肉丸的摻假率高達50%，烤牛肉串和烤羊肉串摻假率分別為36.4%和35.7%。Quinto等[28]利用線粒體CO I基因為靶標，對美國54份野生動物肉制品進行檢測，發現18.5%的商品存在虛假標簽的問題。上述研究證明了DNA條形碼技術在動物肉制品鑒定中的有效性。

2.2 DNA條形碼技術在植物、動物源中藥產品鑒定中的應用

中國已經確定的藥用植物超過11000種，藥材市場上魚目混珠的現象有很多。劉沖[31]等建立的阿魏藥材DNA條形碼ITS2序列鑒別方法可準確、快速地鑒別出阿魏屬藥材的正品和混淆品。張立秋[32]等對白頭翁、朝鮮白頭翁、興安白頭翁3種藥用植物和藥材進行了形態分類和ITS2序列分子鑒別研究，為建立其分子鑒定方法提供有力依據。另外，杜鶴等[29]基于DNA條形碼技術對14份市售鹿茸及其混偽品進行檢測，其結果為鹿茸的鑒別提供了新的可行性方法。張紅印等[30]利用DNA條形碼技術對蜈蚣藥材及其混偽品共50份樣品進行鑒別，為蜈蚣藥材鑒定提供新的方法。以上研究利用DNA條形碼技術對中藥產品進行鑒定，為保障臨床用藥安全和市場監管提供了新的技術手段。

2.4 DNA條形碼技術在海產品鑒定中的應用

DNA條形碼技術在海產品原料的可追溯性方面也特別有效[33]。Maralita等[34]利用DNA條形碼技術對菲律賓市場上貼有標簽的海產品進行鑒定，發現冷凍的沙丁魚和金槍魚魚片有錯帖標簽現象，并且還發現一種標簽為gindara的魚排中含有對人類身體健康有害的魚類。Chin等[35]運用DNA條形碼技術對調味魚罐頭、魚球爆米花及蟹餃等形式的共54種加工海產品進行檢測，發現16%的樣本有錯帖標簽現象。這些研究證明DNA條形碼技術可以成為海鮮產品來源證明的有力工具，也為商業漁類產品的物種識別和真實性測試提供了一種強有力的評估方法。此外，為進一步提高DNA條形碼技術的應用性，Rasmussen等[36]提出了更為經濟的微型DNA條形碼(mini DNA barcodes)技術，該技術可以有效地對經深加工并且DNA已經大量降解的食品進行鑒定[37]。隨著近幾年來mini-DNA條形碼技術在海產品鑒定中的不斷深入運用，Xiong等[38]運用DNA條形碼技術及mini-DNA條形碼技術發現中國市場上的烤鱈魚片產品有58%存在錯貼標簽的現象，并且得出mini-DNA條形碼技術相較普通DNA條形碼技術更為敏感的結論。

3 小結

食品安全是國內外密切關注的熱點。全球貿易談判要求食品在準確的標簽和物種可追溯性方面進行嚴格的認證。因此，各國貿易政策應符合這些要求，要確保食品安全性和可持續性[39]。但是，如果沒有強有力的監測戰略和實施基礎，很難實現這一目標。DNA條形碼技術是物種分類的有效工具，并且在食品錯帖標簽和原料追溯性方面發揮著重要作用。但是，該技術仍存在一些困難和挑戰：首先，該技術依賴參考的數據庫創建不夠完善會導致許多不確定因素；其次，許多食品的原料來源具有相似基因圖譜，線粒體多態性和線粒體DNA修復機制也會給鑒定帶來一定困難[40-42]，此外，該技術還存在不能區分樣本的地理來源和不能準確鑒定雜交物種種屬信息[43]等缺點。

綜上所述，盡管DNA條形碼技術仍存在一些問題，但與常見的形態及理化分析鑒別方法，以及實時熒光定量PCR、SNP等檢測方法相比，DNA條形碼技術的分類覆蓋率高、檢測高通量等優勢使其成為一項越來越適用的分子診斷技術[44]。隨著DNA條形碼數據庫的進一步完善，DNA條形碼技術在食品安全領域的鑒定能力將會得到不斷的強化。隨著越來越多的DNA條形碼引物被設計和完善，標本鑒定過程可以在較短時間內建立并形成易于利用且穩定的系統，實現標準化和數字化[40]，這也將對食品安全監督領域產生巨大的影響[43]。