基于納米水凝膠顆粒的毛細管電泳法分離DNA

張禾蓉 易達 孟子暉 薛敏 汪海林 馮金生

摘?要?采用乳液聚合法，在水相中制備了一系列納米水凝膠顆粒（NPs），基于動態涂層法應用于毛細管電泳分離DNA片段。動態光散射表征結果表明，所制備的NPs分散性好、粒徑分布均勻。基于NPs交聯網絡結構將其作為毛細管電泳分離介質，結果表明，單體的用量、納米顆粒的粒徑以及NPs在毛細管電泳中的濃度對DNA分離效果都有影響。當單體采用N-異丙基丙烯酰胺（87%）、丙烯酸羥乙酯（8%）和丙烯酸（4%），交聯劑為N，N'-亞甲基雙丙烯酰胺（1%）時，通過改變表面活性劑十二烷基磺酸鈉（SDS）的用量，可以改變所制備的納米顆粒粒徑，當SDS用量為53 mg時，NPs粒徑約480 nm。將此NPs（8.0 mg/mL）加入TG緩沖溶液（25 mmol/L Tris，192 mmol/L甘氨酸，pH 8.3）用于毛細管電泳，3個長度DNA片段（20、50和80 nt）可實現完全分離，分離效果好，且遷移時間較短。

關鍵詞?納米水凝膠顆粒; 毛細管電泳; DNA分離

1?引 言

毛細管電泳（Capillary electrophoresis， CE）是以熔融石英毛細管為分離通道，以高壓直流電場為驅動力的新型液相分析技術[1]，具有高效、高分辨率、高靈敏度等特性，在核酸、多肽、蛋白質等生物大分子的分離分析中應用廣泛[2～4]。CE用于DNA分析時，通過在毛細管柱中充入凝膠或聚合物溶液等篩分介質形成凝膠色譜柱，依據DNA片段大小和形狀可以在電泳過程中實現篩分分離[5]。這種凝膠毛細管柱雖然分離效率較高，但是高粘度交聯的聚合物會導致毛細管柱難以制備和維護，近年報道的親水性聚合物溶液篩分體系的應用，很好地解決了這個問題[6]。 Heiger等[7]率先將線性聚丙烯酰胺（Linear polyacrylamide，LPA）用于CE分離DNA，實現了片段長度達12000的堿基對的雙鏈DNA的高效分離。然而，LPA溶液的粘度較高，而且使用LPA溶液時，必須通過化學衍生的方法在毛細管內壁形成一層LPA聚合物涂層，減少DNA片段在毛細管內壁上的吸附以及抑制電滲流（EOF）[8]。這種共價涂層毛細管制備比較復雜，使用壽命短，且難沖洗。研究表明，一些聚合物溶液能夠形成比較穩定的動力學涂層，可用于分離DNA，其機理是通過聚合物溶液和毛細管內壁之間的相互作用（如氫鍵、疏水作用以及靜電作用等）形成的一種物理吸附[9]。常用的聚合物包括聚二甲基丙烯酰胺（PDMA）、聚環氧乙烯（PEO）和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）等。Gao等[10]合成了一種新型的星狀PDMA，將其作為基質用于DNA分離，與線性聚合物相比，該聚合物提高了篩分能力，縮短了分離時間，獲得了較好的分離性能。李玉榮等[11]以PEO為篩分介質，采用硅烷化處理的毛細管柱分離100～5000 bp DNA片段。Gao等[12]在單色測序分離時，采用濃度為7% 的PVP溶液分離了350 bp的DNA 片段。這類具有高親水性、良好的溶解能力且能夠形成動態涂層的分離介質，雖然可以成功地實現DNA分離，但是由于聚合物溶液的粘度太大[13]，導致了毛細管柱難沖洗。

近年來，納米顆粒聚合物[14]、二氧化硅納米顆粒[15]、金納米顆粒[16]?等作為復合分離介質，已成功用于分離DNA[17]和蛋白質[18]。基于其尺寸效應獨特、表面作用位點多、選擇性高、生物相容性好等物化性質，這些納米顆粒分離介質雖可成功分離DNA和蛋白質，但實驗過程繁瑣，不易制備和使用。親水性是影響聚合物溶液動態涂層能力和篩分性能的關鍵因素之一[19]，N-異丙基丙烯酰胺（NIPAm） 具有親水的酰胺基團，將其聚合物用于CE，實現了雙鏈DNA和質粒DNA的分離[20]。以NIPAm單體為基質的納米水凝膠顆粒（Nanoparticles hydrogel， NPs）是一種能在水中顯著溶脹，但不能溶解的親水性聚合物，具有很高的含水量，與生物組織類似，具有良好的生物相容性，近年來，在藥物輸送與釋放[21]、蛋白質識別[22]、醫學診斷[23]等生物領域中顯示了良好的應用前景。由于NPs內部具有交聯網絡結構，因此其穩定性高于聚合物膠束、聚合物囊泡等聚合物納米粒子[24]。

本研究基于NIPAm的親水性及納米顆粒的獨特優點，設計并合成了一系列以NIPAm為基質的納米水凝膠顆粒，將其作為毛細管電泳分離介質分離DNA。考慮到在較寬的生理和病理過程范圍內，較短的DNA 片段對人類的基因表達具有調節作用[25]，實驗選取了20、50和80 nt的DNA片段。通過改變聚合單體和配方，優化分離效果，并探究NPs在DNA分離中的應用可能性以及分離機理。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

Zetasizer Nano-ZS動態光散射粒度儀（馬爾文（中國）有限公司）; JSM-7500掃描電鏡（SEM，荷蘭PHILIPS CZECH公司）; 毛細管電泳-激光誘導熒光分析（CE-LIF）儀器裝置為實驗室自制[26]。熔融石英毛細管（o.d. 365 μm; i.d. 25 μm， 永年縣銳灃色譜器件有限公司）。

丙烯酸（AAc，99%）、N-異丙基丙烯酰胺（NIPAm，99%）、N，N'-亞甲基雙丙烯酰胺（BIS，98%）、三羥甲基氨基甲烷（Tris，99%）、甘氨酸（98%）（北京百靈威科技有限公司）; 丙烯酸羥乙酯（HEAc，99%，阿拉丁試劑有限公司）; 十二烷基硫酸鈉（SDS，分析純，天津市福晨化學試劑廠）; 過硫酸銨（APS，分析純，北京化工廠）; DNA（T×20、T×50、T×80，99%，生工生物工程有限公司）。實驗用水為超純水（艾科浦純水系統AWL-0502-U， 重慶臺浦有限公司）。

2.2?實驗方法

2.2.1?納米水凝膠顆粒的制備?采用乳液聚合法制備納米水凝膠顆粒[27]。將NIPAm（（95-X） mol%）、 AAc（4 mol%）、 BIS（1 mol%）、 SDS（53 mg）溶于120 mL去離子水中，然后加入HEAc（X mol%），在室溫下通N2除氧，磁力攪拌反應120 min; 將反應溫度升至70℃，在N2保護下反應40 min; 取APS（83 mg APS溶于12 mL水中）加入上述溶液中，持續通氮氣并保持攪拌狀態，反應4 h（圖1）。將反應后所得聚合物溶液裝入透析袋（MWCO≤14000 Da）中透析純化5天，除去殘留的反應物原料和表面活性劑。

2.2.2?毛細管電泳分離DNA實驗?截取37 cm、內徑為25 μm的未涂層毛細管裸管（從進樣口到檢測窗口距離30 cm），使用前用0.1 mol/L NaOH沖洗2 h。應用分離電壓為+20 kV，電動進樣5 s（電壓為+15 kV）。運行緩沖溶液為TG溶液（25 mmol/L Tris，192 mmol/L甘氨酸，pH 8.3）中加入一定濃度的NPs，樣品緩沖溶液為Tris-HCl溶液（50 mmol/L，pH 7.5）。所有的分離都在室溫下進行，每次分析后，毛細管依次使用0.02 mol/L NaOH沖洗5 min、水沖洗2 min、緩沖液沖洗5 min。

3?結果與討論

3.1?納米水凝膠顆粒的表征

納米水凝膠顆粒（NPs）采用3種單體NIPAm、HEAc和AAc共聚而成，通過改變配方，制備了一系列NPs，并經DLS檢測，獲得其粒徑、分散性、表面電動勢等性質（表1）。

由表1可見，通過改變聚合物配方，獲得了粒徑和表面電動勢均不同的NPs，且HEAc用量越大，表面電動勢絕對值越高。所制備的聚合物納米小球分散指數PDI<0.2，分散性良好。DLS檢測結果（圖2）表明，NPs粒徑分布均勻。

3.2?NPs制備中HEAc用量對DNA分離效果的影響

通常，熔融石英毛細管內壁帶負電，在貼近管壁的液體表面會形成一個帶正電荷的離子層，將所制備的NPs加入毛細管電泳運行緩沖溶液時，帶負電基團的聚合物顆粒可通過靜電作用吸附在毛細管內壁上形成吸附涂層，起到抑制電滲流和DNA的吸附作用。在NPs制備中，HEAC單體提供負電荷，由表1可見，控制AAc摩爾百分比不變，HEAc用量從0增加至24%時， NPs表面電動勢為負值，絕對值從4.99增加到6.79。

將8.0 mg/mL NPs分別加入到運行緩沖溶液TG中，配制成不同的篩分介質，考察基于不同HEAC用量制備的NPs對3個不同片段DNA的分離效果。如圖3所示，采用4種NPs作為復合分離介質加入運行緩沖溶液分離目標DNA，在3 min之內均完成實驗。其中，采用NP1、NP3以及NP4的分離效果較差，而采用NP2的運行緩沖溶液對3個DNA片段基本實現了基線分離。這是由于當帶負電荷的HEAc摩爾百分比增加時，所制備的NPs電荷斥力增強，帶負電基團的NPs表面電動勢絕對值越大，通過靜電作用在毛細管內壁上形成的吸附涂層越穩定，使得其分離度增大，但是電荷斥力過強，可能導致NPs自身相互排斥，削弱涂層的吸附能力。

3.3?NPs粒徑對DNA分離效果的影響

考察了NPs粒徑大小對DNA的分離效果。在NPs制備過程中，保持其它條件不變，通過改變SDS用量（5、25和53 mg），制備得到不同粒徑的NPs（650、600和480 nm），此結果與文獻[28]相符。將這3種NPs分別加入緩沖溶液分離DNA，分離效果如圖4所示，可見隨著NPs粒徑減小， DNA的分離效果有所提高。推測可能是因為粒徑小的NPs具有較大的比表面積，且形成了合適的篩分網絡結構，對不同的DNA片段產生的阻礙作用不同; 而粒徑較大的NPs形成的篩分網絡結構不能有效分離不同片段的DNA，而且粒徑較大的NPs分散性較差，容易團聚。

3.4運行緩沖溶液中NPs的濃度對DNA分離效果的影響

根據上述優化實驗結果，在運行緩沖溶液TG中加入不同濃度的NP2，對3個不同片段DNA的分離效果如圖5所示。

由圖5A可見，空白實驗僅采用運行緩沖溶液TG，不加入任何NPs，此時，3個片段DNA完全無法分離; 通過改變NPs加入量，分離效果有所改善; 當NPs濃度為8.0 mg/mL時（圖5C），3個DNA片段實現了基線分離。這是因為以電滲流（EOF）為驅動力的電泳過程分離DNA是根據其大小和形狀進行篩分的，因此，具有高親水性、良好的篩分能力以及動態涂層能力的聚合物水溶液通過吸附在毛細管內壁，形成相對穩定的動力學涂層，可抑制電滲流（EOF）及DNA 片斷和毛細管管壁的吸附作用，從而實現對DNA片段的篩分。本研究中，增加聚合物濃度相當于增大了聚合物鏈網絡結構，從而形成了微孔篩分聚合物網絡。當NPs濃度較低時，沒有形成動態的物理網絡結構，分離性能不佳。隨著NPs濃度增加，聚合物鏈網絡結構增大，當NPs濃度為8.0 mg/mL時，各片段DNA按大小依次通過篩孔實現分離。當NPs的濃度繼續增大時，聚合物鏈網絡結構緊密，形成的篩分孔徑減小，增大了DNA的遷移阻力，使得分離度減小。

3.5?NPs分離DNA的作用機理探討

為了更好地理解NPs作為復合分離介質對DNA分離效果的影響，實驗時將NPs灌入毛細管，采用掃描電鏡（SEM）觀測毛細管中NPs存在形式（圖6）。

由圖6可見，毛細管內壁吸附了一層或者多層NPs。由于NPs表面具有大量羥基，與毛細管內壁上的硅羥基形成氫鍵，同時，NPs帶負電荷，與管壁正電荷離子層結合。NPs在管壁的吸附，降低了毛細管內壁與DNA間的作用，有效地抑制了DNA 片斷在毛細管內壁上的吸附，對毛細管起到了涂層作用。DNA分離過程采用的運行緩沖溶液由TG和親水性NPs構成，使得NPs在毛細管內壁涂層形成過程動態可逆，動態涂層易于形成和再生，最終實現動態平衡[29]。

近年來，二氧化硅納米顆粒、金納米顆粒等已成功用于CE分離DNA和蛋白質，相比這些納米材料，本研究所制備的納米水凝膠顆粒易于合成，且不需要作為固定相提前加入毛細管柱，可直接加入緩沖溶液實現分離，操作簡單， 不易堵塞毛細管柱。

本研究制備的NPs以溫敏性單體NIPAm作為結構框架，因此具有溫敏性[30]，在較低臨界溶解溫度（LCST）下發生相轉變。當溶液溫度低于LCST時，NPs的親水部分與水分子間氫鍵作用占主導地位，凝膠網絡外圍將形成一種由氫鍵為主要作用力且高度有序的溶劑殼層，而形成一個相對穩定和網孔大小均一的物理網絡結構。當外界溫度高于LCST時，凝膠分子的疏水作用加強，形成的疏水層破壞了外圍的氫鍵作用與溶劑殼層，溫度升高至LCST時水分子從凝膠中排出，因此發生了由線團到球形結構的構像轉變[31]，如圖7所示。

當環境溫度低于LCST時，NPs發生溶脹，溶液較清澈，高于LCST時，NPs收縮為粒徑較小的納米小球，溶液比較渾濁（圖7）。在毛細管聚合物溶液電泳中，DNA的分離性能很大程度上取決于篩分聚合物的物理性質[32]，因此，緩沖溶液中NPs的交聯網狀結構形成的空間結構與分離效果密切相關。當DNA片段遷移時，核酸分子碰撞進入水凝膠溶液的網絡結構中，較大的分子片段只能進入孔徑較大的凝膠孔隙內，而較小分子片段可進入較多的凝膠顆粒內。大分子片段在凝膠網絡結構中移動的距離較短，較小片段分子的移動距離較長， 當NPs形成了有效的篩分網絡結構時，即可對不同片段的DNA實現分離。

4?結 論

采用乳液聚合法，通過調整合成配方，得到一系列具有交聯網狀結構且粒徑均勻可調的納米水凝膠顆粒，并將其用于毛細管電泳分離DNA。通過考察納米水凝膠顆粒的單體配比、粒徑大小及濃度對DNA分離效果的影響，得到分離DNA的最優配方。實驗結果表明，納米水凝膠顆粒具有高親水性、良好的篩分性能、穩定性以及生物友好性等優點，濃度低，易于制備和使用，是一種比較理想的篩分介質，在毛細管電泳對DNA及其它生物大分子的分離中具有良好的應用前景。

References

1?DING Xiao-Jing， GUO Lei. Capillary Electrophoresis Experimental Techniques. Beijing： Science Press， 2015

丁曉靜， 郭 磊. 毛細管電泳實驗技術. 北京： 科學出版社， 2015

2?Domínguez V E， Haselberg R， Somsen G W， Jongde G J. Anal. Chem.， 2015， 87（17）： 8781-8788

3?Finetti C， Sola L， Elliott J， Chiari M. J. Chromatogr. A， 2017， 15（13）： 226-234

4?WANG Hai-Lin， ZHANG Da-Peng， WANG Zhi-Xin， LI Tao， FENG Feng， WANG Chao， GAO Hai-Yan. Chinese Journal of Chromatography， 2009， 27（5）： 642-647

汪海林， 章大鵬， 王智鑫， 李 濤， 馮 峰， 王 超， 高海燕. 色譜， 2009， 27（5）： 642-647

5?WANG Qian， XU Xu. Prog. Chem.， 2003， 15（4）： 275-287

王 前， 許 旭. 化學進展， 2003， 15（4）： 275-287

6?Xu F， Baba Y. Electrophoresis， 2004， 25（14）： 2332-2345

7?Heiger D N， Cohen A S， Karger B L. J. Chromatogr. A， 1990， 516（1）： 33-48

8?Hjertén S. J. Chromatogr.， 1985， 347： 191-198

9?Chu B， Liang D. J. Chromatogr. A， 2002， 966（2）： 1-13

10?Gao F， Cai T， Zhang X X， Niu Z Q， He X J， Ma Y G. J. Chromatogr. A， 2011， 1218： 3037-3041

11?LI Yu-Rong， CHEN Chang-Bao， ZHOU Jie. Chem. J. Chinese Universities， 2011， 32（4）： 844-850

李玉榮， 陳長寶， 周 杰. 高等學校化學學報， 2011， 32（4）： 844-850

12?Gao Q， Yeung E S. Anal. Chem.， 1998， 70（7）： 1382-1388

13?REN Ji-Cun， FANG Zheng-Fa. Chinese J. Anal. Chem.， 2002， 30（1）： 6-8

任吉存， 方正法. 分析化學， 2002， 30（1）： 6-8

14?Gonzálezcurbelo M ， Varelamartínez D A， Socasrodríguez B， Hernndez B. Electrophoresis， ?2017， 38（19）： 2431-2446

15?Li H， Ding G S， Chen J， Tang A N. J. Chromatogr. A， 2010， 1217（47）： 7448-7454

16?Zhao T， Zhou G， Wu Y， Liu X， Wang F. Electrophoresis， 2015， 36（4）： 588-595

17?Huang M F， Kuo Y C， Huang C C， Chang H T. Anal. Chem.， 2004， 76（1）： 192-196

18?Nilsson C， Becker K， Harwigsson I， Bulow L， Birnbaum S， Nilsson S. Anal. Chem.， 2009， 81（1）： 315

19?Doherty E A S， Berglund K D， Buchholz B A， Kourkine I V， Przybycien T M， Tilton R D， Barron A E. Electrophoresis， 2002， 23（16）： 2766-2776

20?Zhou P， Yu S， Liu Z， Hu J， Deng Y. J. Chromatogr. A， 2005， 1083（12）： 173-178

21?Luo Y L， Zhang X Y， Fu J Y， Xu F， Chen Y S. Int. J. Polym. Mater.， 2017， 66（8）： 398-409

22?Koide H， Yoshimatsu K， Hoshino Y， Lee S H， Okajima A， Ariizumi S， Narita Y， Yonamine Y， Weisman A C， Nishimura Y， Oku N， Miura Y， Shea K J. Nat. Chem.， 2017， 9（7）： 715-722

23?Conde J， Oliva N， Zhang Y， Artzi N. Nat. Mater.， 2016， 15（10）： 1128-1138

24?SHAN Bing-Hui， WANG Chao-Zhan， WEI Yin-Mao. Chinese J. Anal. Chem.， 2016， 44（7）： 1119-1124

單丙輝， 王超展， 衛引茂. 分析化學， 2016， 44（7）： 1119-1124

25?Li T， Zhang D， Luo W， Lu M， Wang H. Anal. Chem.， 2010， 82（2）： 487-490

26?Wang H， Lu M， Tang M S，Van Houten B， Ross J B A， Weinfeld M， Le X C. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 2009， 106（31）： 12849-12854

27?Hu Z， Lu X， Gao J. Adv. Mater.， 2001， 13（22）： 1708-1712

28?Wedel B， Brndel T， Bookhold J， Hellweg T. ACS Omega， 2017， 2（1）： 84-90

29?Ban E， Yoo Y S， Song E J. Talanta， 2015， 141： 15-20

30?WANG Zhe， XUE Min， MENG Zi-Hui， JI Tian-Tian， XIE Teng-Sheng. Chinese J. Anal. Chem.， 2018， 46（3）： 317-323

王 哲， 薛 敏， 孟子暉， 吉田田， 謝騰升. 分析化學， 2018， 46（3）： 317-323

31?Beierle J M， Yoshimatsu K， Chou B， Mathews M A A， Lesel B K， Shea K J. Angew. Chem.， 2014， 126（35）： 9429-9433

32?Liu C， Yamaguchi Y， Dou X. Int. J. Mod. Phys. B， 2017， 31： 1744094