血必凈注射液對(duì)SAP大鼠TLR4信號(hào)通路介導(dǎo)腸黏膜屏障功能障礙的影響

歐 婭 黃耀星 蘇 偉 羅鍵雄 陳偉明 唐 翔 陳泳華 張婷婷

廣州市第一人民醫(yī)院，華南理工大學(xué)附屬第二醫(yī)院(廣州 510180)

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)是臨床較常見的危重癥，病情兇險(xiǎn)危重，并發(fā)癥較多，死亡率居高不下[1]。胰酶原位激活并自身消化引起的全身性炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammation response sydrome, SIRS)被認(rèn)為是SAP的主要發(fā)病機(jī)制，常導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction sydrome, MODS)[2]的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，早期應(yīng)用血必凈注射液能減輕SAP大鼠腸黏膜屏障損傷[3]，但其機(jī)制尚未完全明確。本文通過觀察血必凈注射液對(duì)SAP大鼠小腸組織TLR4和NF-κB表達(dá)以及血清TNF-α、IL- 6、AMS及DAO水平的影響，探討血必凈注射液對(duì)SAP大鼠TLR4信號(hào)通路介導(dǎo)腸黏膜屏障功能障礙(intestinal mucosal barrier dysfunctional, IMBD)的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

SPF級(jí)成年SD大鼠24只(購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)，體質(zhì)量230～280 g，按數(shù)字隨機(jī)法分為空白組(n=8)、對(duì)照組(n=8)和治療組(n=8)。所有大鼠均遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求進(jìn)行飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)操作。

1.2 制備模型和獲取標(biāo)本

制模前禁食12 h，可自由飲水。大鼠稱重后麻醉，腹腔注射質(zhì)量濃度為100 g/L的戊巴比妥鈉(3 mL/kg)。麻醉成功后仰臥并固定四肢，腹部去毛消毒，上腹部正中切口2～3 cm進(jìn)腹，尋找十二指腸并提取膽總管，以4號(hào)鈍性針頭穿透膽胰管對(duì)側(cè)的十二指腸壁，進(jìn)入膽胰管約5 mm，以無(wú)損傷血管夾固定針頭。治療組和對(duì)照組經(jīng)膽胰管逆行注射質(zhì)量濃度為45 g/L的牛磺膽酸鈉溶液(1 mL/kg，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司)，保留3min后松開無(wú)損傷血管夾并抽出針頭，縫合關(guān)腹。空白組予等量生理鹽水逆行膽胰管注射。治療組造模3 h后經(jīng)鼠尾靜脈予3 mL/kg劑量注射血必凈注射液(天津紅日藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z2000403)。造模后觀察24 h，鼠尾靜脈采血送檢，然后處死動(dòng)物并留取小腸組織及胰腺組織送病理檢查。

1.3 病理檢查

留取大鼠胰腺及小腸組織，質(zhì)量濃度為100 g/L的甲醛緩沖液固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片、HE染色，由專一病理醫(yī)師觀察切片，按照Schemidt標(biāo)準(zhǔn)[4]進(jìn)行胰腺組織病理評(píng)分，按照Chiuls分級(jí)[5]進(jìn)行小腸組織病理評(píng)分。

1.4 TLR4和NF-κB表達(dá)的檢測(cè)

適量小腸組織研磨至勻漿，低速離心后取上清通過Trizol 法分離提取RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄及RT-PCR技術(shù)后，采用免疫熒光定量檢測(cè)TLR4和NF-κB的表達(dá)水平，然后gapdh為內(nèi)參，通過△△CT法，結(jié)果以表達(dá)倍數(shù) [2^(-k)]表示。TLR4引物序列：F: 5′-GCCGGAAAGTTATTGTGGTGGT-3′，R: 5′-AT GGGTTTTAGGCGCAGAGTTT-3′。NF-κB引物序列：F: 5′-GGTAGTCCTGATCATGAACTCCC-3′，R: 5′-CC TGGTGCAAATC GTACACAGGC-3′。

1.5 血清炎癥因子、AMS及DAO的檢測(cè)

取外周靜脈血，經(jīng)低速離心后取上清，通過酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)血清TNF-α、IL- 6、AMS及DAO的水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 一般情況

空白組大鼠體質(zhì)量(248.4±5.2)g，對(duì)照組大鼠體質(zhì)量(245.6±8.6)g，治療組大鼠體質(zhì)量(242.2±7.8)g，組間體質(zhì)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。空白組大鼠未見明顯異常，造模24 h內(nèi)無(wú)死亡；對(duì)照組大鼠有呼吸急促、明顯腹脹、反應(yīng)遲鈍、無(wú)大便排出等表現(xiàn)，造模24 h內(nèi)死亡2只；治療組大鼠有腹脹，反應(yīng)較遲鈍，多數(shù)排稀爛便，造模24 h內(nèi)死亡1只。

2.2 胰腺和小腸組織病理改變及評(píng)分

造模24 h后，空白組胰腺組織無(wú)明顯改變，對(duì)照組胰腺組織呈明顯炎癥性改變，治療組胰腺組織存在炎癥性改變，但較對(duì)照組稍輕，見圖1。

空白組病理檢查未見小腸組織有明顯改變；對(duì)照組病理檢查發(fā)現(xiàn)小腸黏膜結(jié)構(gòu)破壞明顯，絨毛上皮充血水腫，可見局部上皮脫落及潰瘍形成，固有層可見毛細(xì)血管及淋巴管擴(kuò)張，多種圓形細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，毛細(xì)血管內(nèi)可見紅細(xì)胞集聚；治療組病理檢查發(fā)現(xiàn)腸黏膜結(jié)構(gòu)破壞，黏膜層充血水腫和固有層細(xì)胞浸潤(rùn)較對(duì)照組輕。見圖2。

A： 空白組 B： 對(duì)照組 C： 治療組圖1 各組胰腺組織的病理變化(HE ×50)

A： 空白組 B： 對(duì)照組 C： 治療組圖2 各組小腸組織的病理變化(HE ×50)

對(duì)照組和治療組的胰腺和小腸病理評(píng)分高于空白組(P<0.05)，治療組胰腺和小腸評(píng)分低于對(duì)照組(P<0.05)，見表1。

2.3 小腸組織TLR4和NF-κB表達(dá)

對(duì)照組和治療組小腸組織TLR4和NF-κB表達(dá)水平高于空白組(P<0.05)，治療組小腸組織TLR4和NF-κB表達(dá)水平低于對(duì)照組(P<0.05)，見表2。

2.4 血清炎癥因子

對(duì)照組和治療組血清TNF-α、IL- 6、AMS和DAO的水平對(duì)照組高于空白組(P<0.05)。治療組血清TNF-α、IL- 6、AMS和DAO水平較低于對(duì)照組(P<0.05)。見表3。

2.5 血清AMS和DAO

對(duì)照組和治療組血清AMS和DAO的水平較對(duì)照組高于空白組(P<0.05)。治療組血清AMS和DAO水平較低于對(duì)照組(P<0.05)。見表4。

表1 各組的胰腺和小腸病理評(píng)分

*與空白組比較,**與對(duì)照組比較

表2 各組的TLR4和NF-κB表達(dá)水平

*與空白組比較,**與對(duì)照組比較

表3 各組的血清炎癥因子水平

*與空白組比較，**與對(duì)照組比較

表4 各組的血清AMS和DAO

*與空白組比較，**與對(duì)照組比較

3 討 論

炎癥反應(yīng)在SAP發(fā)病過程中起著重要作用。各種誘因?qū)е乱让冈患せ畈⒁鹨认僮陨硐軗p的腺泡分泌IL- 6和TNF-α等炎癥因子，激活外周血單核細(xì)胞，進(jìn)一步釋放炎癥因子再次損傷腺泡細(xì)胞，形成惡性循環(huán)并發(fā)展為SIRS，最終導(dǎo)致MODS的發(fā)生[6]。SAP可導(dǎo)致有效循環(huán)血量明顯減少、腸道缺血-再灌注損傷以及炎癥因子的大量釋放入循環(huán)，腸道肌層能動(dòng)性受損，腸黏膜屏障功能障礙，腸黏膜水腫并通透性增加，腸源性革蘭陰性菌及內(nèi)毒素穿過腸黏膜屏障易位入血，激活中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞等炎癥反應(yīng)細(xì)胞，產(chǎn)生更多的TNF-α、 IL-1、IL- 6等炎癥因子，造成“二次打擊”[7]。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)主要介導(dǎo)革蘭陰性細(xì)菌感染后脂多糖(LPS)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，其活化后主要通過髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88, MyD88)依賴性信號(hào)通路介導(dǎo)活化下游包含NF-κB在內(nèi)的多個(gè)信號(hào)通路，引起以TNF-α等為中心的炎癥因子激活，從而導(dǎo)致多種炎癥因子的瀑鏈?zhǔn)结尫哦a(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)[8]。TNF-α是在重癥急性胰腺炎早期引起全身性表現(xiàn)的重要因子，也是引起多器官功能衰竭的重要因素之一，而IL- 6主要由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等在TNF-α等誘導(dǎo)下釋放的一種細(xì)胞因子，它除對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及炎性細(xì)胞具有直接的激活和毒性作用外，更主要的是誘導(dǎo)急性期蛋白的合成，催化和放大炎性反應(yīng)，造成組織細(xì)胞的損害。同時(shí)，炎癥反應(yīng)中大量生產(chǎn)TNF-α反過來(lái)又可再激活NF-κB信號(hào)通路，形成一個(gè)具有放大效應(yīng)的環(huán)路，即“瀑布效應(yīng)”，進(jìn)一步加劇炎癥反應(yīng)的發(fā)展及組織的破壞，導(dǎo)致MDOS的發(fā)生[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組和治療組小腸組織TLR4和NF-κB表達(dá)、血清TNF-α和IL- 6水平顯著高于空白組(P<0.05)，提示SAP發(fā)病過程中，小腸組織TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活，并活化其下游的NF-κB信號(hào)通路，上調(diào)TNF-α等炎癥因子的表達(dá)。

二胺氧化酶(diamine oxidase, DAO)存在于哺乳動(dòng)物的黏膜上層和絨毛上層細(xì)胞中，大部分位于小腸黏膜，血漿中含量極低。當(dāng)腸黏膜通透性增加時(shí)，DAO就會(huì)通過受損的黏膜入血，故監(jiān)測(cè)血中DAO水平可及時(shí)反映腸黏膜損傷程度和通透性變化，成為腸黏膜損傷的重要指標(biāo)[3]，而最新研究證實(shí)，血漿DAO含量的高低與腸黏膜的受損程度相關(guān)[10]。朱毅東[11]等研究也發(fā)現(xiàn)，在SAP患者血漿TNF-α等炎癥因子水平顯著升高時(shí)，血漿DAO水平也伴隨著顯著升高，提示兩者存在相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組和治療組血清AMS和DAO水平高于空白組(P<0.05)，血清TNF-α和IL- 6也高于空白組(P<0.05)，提示SAP發(fā)病過程中，SIRS導(dǎo)致循環(huán)中存在大量的炎癥因子，失控性炎癥反應(yīng)損傷包括胰腺和小腸在內(nèi)的器官組織，導(dǎo)致胰腺損傷和IMBD。

中醫(yī)認(rèn)為SAP的實(shí)質(zhì)是“實(shí)熱內(nèi)蘊(yùn)，瘀熱互結(jié)”，故治療上應(yīng)以解毒通瘀為主[12]。血必凈注射液是王今達(dá)教授以古方血府逐瘀湯為基礎(chǔ)煉制出來(lái)的靜脈制劑，其主要成分包括丹參、紅花、當(dāng)歸、赤芍、川芎等，具有清熱解毒、扶正祛邪和活血化瘀等奇效。臨床研究發(fā)現(xiàn)，血必凈注射液可有效控制SAP患者病情發(fā)展，降低APACHEⅡ評(píng)分，調(diào)高治愈率[13]，并能降低SAP患者血TNF-α、IL- 6和C反應(yīng)蛋白水平[14]，在常規(guī)治療基礎(chǔ)上聯(lián)用治療SAP具明顯的優(yōu)勢(shì)[15]。本研究也發(fā)現(xiàn)，治療組小腸組織TLR4和NF-κB表達(dá)以及血清TNF-α、IL- 6、AMS和DAO水平低于對(duì)照組(P<0.05)，提示血必凈注射液可能通過下調(diào)TLR4及下游信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)活化，減少以TNF-α等為中心的多種炎癥因子的表達(dá)，弱化機(jī)體炎癥反應(yīng)，降低機(jī)體SIRS，從而達(dá)到降低腸黏膜屏障損傷的效果，對(duì)IMBD具有一定的保護(hù)作用。

綜上所述，SIRS在SAP發(fā)病過程中起著重要作用，IMBD與腸道組織炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。血必凈注射液可降低小腸組織TLR4和NF-κB的表達(dá)，下調(diào)SAP大鼠血清TNF-α、IL- 6、AMS和DAO水平，減輕小腸組織炎癥反應(yīng)，可能通過干預(yù)TLR4及其下游信號(hào)通路延緩IMBD的發(fā)生，對(duì)腸黏膜屏障具有一定的保護(hù)作用，但其中具體機(jī)制尚未完全明確，有待進(jìn)一步研究明確其詳細(xì)機(jī)制。