胸苷激酶1在胸腔積液鑒別診斷中的作用研究

程江濤 劉清毅 楊印樓 張宏華 馬占忠 尹迎秋 龔 梅

韶關(guān)市粵北人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科(韶關(guān) 512026)

胸腔積液是呼吸系統(tǒng)的一大類常見疾病，其中以肺炎旁胸腔積液、結(jié)核性胸腔積液及惡性胸腔積液為多見[1]，三種胸腔積液的治療方案及預(yù)后有極大差別，因此其鑒別診斷就成為臨床工作中十分重要的課題。對于上述三類胸腔積液的鑒別診斷，診斷“金標(biāo)準(zhǔn)”分別為是細(xì)菌學(xué)診斷及病理學(xué)診斷，但無論細(xì)菌學(xué)檢查及病理學(xué)檢查，均存在陽性率低、耗時長等問題。 因此，需要篩選生化指標(biāo)或免疫學(xué)指標(biāo)以鑒別診斷這三類胸腔積液。

人類細(xì)胞中胸苷激酶(thymidine kinase,TK)有兩形式： TK1(細(xì)胞質(zhì)胸苷激酶) 和 TK2(線粒體胸苷激酶) 。TK1存在于細(xì)胞質(zhì)中，是DNA合成的關(guān)鍵酶，與細(xì)胞增殖密切相關(guān)。存在于線粒體中的TK2的表達(dá)與細(xì)胞周期是無關(guān)的Aufderklamm S[2]等在 Cancer Letters上發(fā)表的文章指出，TK1是DNA合成期S期的特殊標(biāo)志酶，與DNA合成呈正相關(guān)，它反映細(xì)胞增殖活性及增殖期細(xì)胞比例;當(dāng)TK1的水平明顯升高時，表示細(xì)胞處于異常增殖狀態(tài)。有研究表明血清TK1(S-TK1) 的蛋白表達(dá)水平與腫瘤分期相關(guān)[3]。TK1被認(rèn)為是實(shí)體瘤診斷和預(yù)后評估的一種可靠的指標(biāo)。當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)細(xì)胞異常增殖，特別是惡性腫瘤時，TK1的活性及含量均明顯增高，可超過正常水平的20～100 倍[4]。胸苷激酶1已被普遍用于腫瘤的早期篩查診斷、評估療效和預(yù)后監(jiān)測，但多數(shù)研究其在血清中的濃度，在漿膜腔積液中研究較少。本研究探討胸腔積液中的TK1水平在胸腔積液的表達(dá)，和對三種不同種類胸腔積液的診斷效能，為胸腔積液性質(zhì)的鑒別診斷提供有價(jià)值的參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年10月31日—2016年7月31日在廣東省韶關(guān)市粵北人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科住院的胸腔積液患者共 60 例。肺炎旁胸腔積液診斷標(biāo)準(zhǔn)包括①肺炎旁胸腔積液(符合以下全部條件)診斷標(biāo)準(zhǔn)： 胸水透明，pH>7.2，LDH<血清正常上限的3倍，胸水葡萄糖 >2.2 mmol/L，胸腔積液涂片革蘭染色陰性或病原學(xué)培養(yǎng)陰性[5]。②結(jié)核性胸腔積液診斷標(biāo)準(zhǔn)(符合以下任一條件)： a.胸膜活檢示結(jié)核性肉芽腫或干酪樣壞死并見抗酸桿菌；b.胸膜活檢示炎性肉芽腫或干酪樣壞死，未見抗酸桿菌，但臨床及影像學(xué)上提示對抗結(jié)核治療效果很好[6]。③癌性胸腔積液診斷標(biāo)準(zhǔn)： 胸腔積液脫落細(xì)胞學(xué)或經(jīng)皮穿刺胸膜活體組織檢查見癌細(xì)胞。排除標(biāo)準(zhǔn)： 曾予抗感染和/或抗結(jié)核的胸腔積液患者。其中男38例 (63.3%)，女 22例(36.7%)，年齡 33～78歲。肺炎旁胸腔積液(炎癥組)20例，結(jié)核性胸腔積液(結(jié)核組)20例，癌性胸腔積液(癌性組)20例。三組患者一般資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，有可比性。

1.2 標(biāo)本采集及檢測方法

①標(biāo)本收集： 新鮮胸腔積液 10 mL，在4 ℃低溫離心機(jī)以1 500 r/min離心15min，去除上清液，用冰冷PBS液(pH 7.4，T 4 ℃) 清洗兩次后，將沉渣細(xì)胞移入1.5 mL Eppendorf管，置-80 ℃冰箱凍存，集中檢測。②樣本檢測： 采用雙抗體夾心法測定TK1濃度。分析儀器采用科華酶標(biāo)儀(KHB-st360)，TK1檢測用試劑盒由深圳市安群生物過程有限公司提供。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)分析使用 SPSS 22.0 軟件，組間比較采用單因素方差分析SNK檢驗(yàn)，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以 SPSS 22.0做診斷價(jià)值分析。

2 結(jié) 果

2.1 三組胸苷激酶1水平比較

癌性組胸苷激酶1濃度 (2.07±1.47)pmol/L，與炎癥組的(1.18±0.73)pmol/L和結(jié)核組的(1.31±0.64)pmol/L比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；炎癥組與結(jié)核組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組胸苷激酶1濃度

2.2 胸苷激酶1在胸腔積液鑒別診斷中的診斷效能

①胸苷激酶1鑒別肺炎旁胸腔積液和結(jié)核性胸腔積液的價(jià)值： AUC=0.57，P=0.449，置信區(qū)間為(0.39，0.751)。見圖1。

②胸苷激酶1鑒別肺炎旁胸腔積液和癌性胸腔積液的價(jià)值： AUC=0.735，P=0.011，置信區(qū)間為(0.58，0.89)。 當(dāng)胸苷激酶濃度的診斷界值為1.27 pmol/L 時，Youden 指數(shù)最大。此時敏感度為0.75，特異度為0.70， Youden指數(shù)為0.45。見圖2。

圖2 肺炎旁胸腔積液與癌性胸腔積液胸苷激酶ROC圖

③胸苷激酶1鑒別結(jié)核性腔積液和癌性胸腔積液的診斷價(jià)值： AUC=0.684，P<0.047，置信區(qū)間為(0.519，0.849)。 當(dāng)胸苷激酶1濃度的診斷界值為1.28 pmol/L時，Youden指數(shù)最大。此時敏感度為0.75，特異度為0.55，Youden指數(shù)為0.30。見圖3。

圖3 結(jié)核性胸腔積液與癌性胸腔積液胸苷激酶1ROC圖

3 討 論

生理狀態(tài)下，胸膜腔內(nèi)為負(fù)壓，平靜呼氣末胸膜腔內(nèi)壓約為- 0.665～0.399 kPa(- 0.67～0.4 mmHg)，其內(nèi)含5～15 mL胸腔積液，其主要作用是加強(qiáng)胸壁與肺臟之間的連接，使其在剪切力作用下相互滑動[7]。胸腔積液的產(chǎn)生和吸收通常保持著動態(tài)平衡，無論何種原因?qū)е缕洚a(chǎn)生過多和/或吸收減少，都會出現(xiàn)胸腔積液[1]。通過體格檢查及B超、胸片或胸部CT等輔助檢查手段，判斷患者是否存在胸腔積液并不困難，下一步需要行胸腔穿刺抽取胸腔積液，判斷胸腔積液的性質(zhì)，即確定是滲出液還是漏出液。Light標(biāo)準(zhǔn)可較好地回答這一問題，其診斷的敏感度和特異度分別到達(dá)99%和98%[8]。如果是漏出液，進(jìn)一步尋找病因，如心源性、肝源性或腎源性等疾病。如果是滲出液，進(jìn)一步需要判斷是炎癥性或者癌性胸腔積液，可以行胸腔積液生化、免疫及脫落細(xì)胞學(xué)檢查，或者采取閉式針刺胸膜活檢、胸腔鏡、開胸肺胸膜活檢等方法明確診斷。炎癥性積液中，以肺炎旁胸腔積液、結(jié)核性胸腔積液為多，這三種胸腔積液的治療方案及預(yù)后有極大差別，肺炎旁胸腔積液經(jīng)予常規(guī)抗感染治療可治愈；結(jié)核性胸腔積液則需要“早期、規(guī)律、聯(lián)合、適量、全程”的抗結(jié)核治療才可能達(dá)到治愈目的；而惡性胸腔積液常常是肺部或其他部位癌性腫瘤轉(zhuǎn)移所致，在國際TNM分期中屬于晚期腫瘤的指標(biāo)之一，亦可見于胸膜間皮瘤等胸膜原發(fā)惡性腫瘤，需要化療、靶向治療或者免疫治療，其預(yù)后最差。可見胸腔積液的鑒別診斷就成為臨床工作中十分重要的課題。對于上述肺炎旁胸腔積液、結(jié)核性胸腔積液、癌性胸腔積液三類胸腔積液的鑒別診斷， “金標(biāo)準(zhǔn)”是細(xì)菌學(xué)診斷及病理學(xué)診斷，即在胸腔積液中查見細(xì)菌、結(jié)核桿菌或腫瘤細(xì)胞或組織，但是以上幾種檢查方法均存在陽性率低、耗時長等問題。因此，從胸腔積液中篩選出能夠有效地鑒別這三種胸腔積液的生化或免疫學(xué)指標(biāo)意義重大。

TK1是評估增殖細(xì)胞增殖度的重要標(biāo)志，是細(xì)胞周期S期(合成期)的特殊酶，也是 DNA合成和損傷修復(fù)的關(guān)鍵酶之一，濃度與細(xì)胞增殖狀態(tài)緊密聯(lián)系。編碼TK1的基因位于17號染色體q21-22 的位點(diǎn)上，胸苷激酶有兩種同工酶： 細(xì)胞質(zhì)胸苷激酶(TK1)和線粒體胸苷激酶(TK2)。TK1催化脫氧胸苷磷酸化生成脫氧胸苷—磷酸(thymidine monophosphate，TMP)，進(jìn)而形成脫氧胸苷三磷酸(thymidine triphosphate，TTP)參與DNA合成[9]。生理狀態(tài)下，成人體內(nèi)TK1含量極少，當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)大量增殖細(xì)胞時，細(xì)胞急劇增殖、壞死，TK1釋放到外周血的概率成倍增加，導(dǎo)致TK1活性及含量都會升高，可超過正常水平的2～100倍[10]。高水平的TK1主要出現(xiàn)在胎兒組織或成人組織的增殖細(xì)胞中，如再生的肝臟、脾臟、胸腔積液、骨髓以及胎兒的脂肪組織，另外，在一些贅生性疾病 (如惡性腫瘤以及某些病毒感染等) 患者的血清和癌癥細(xì)胞中TK1活性也很高。TK1作為一種較好的細(xì)胞增殖標(biāo)志物，可用于臨床體檢篩查、評估手術(shù)效果、監(jiān)測化療進(jìn)程、預(yù)測復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)和判斷腫瘤預(yù)后等[11-12]。因此，該指標(biāo)常用于腫瘤的普查篩選、對進(jìn)程為腫瘤疾病的患者區(qū)分檢測、監(jiān)測治療效果、病程發(fā)展的預(yù)后指示、評估癌癥復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。但需要注意的是，除了惡性腫瘤，TK1在妊娠期及月經(jīng)期婦女、獻(xiàn)血員等人群中可能增高，這同樣是因?yàn)榧?xì)胞增殖的結(jié)果。

既往研究證實(shí)，TK1表達(dá)與腎細(xì)胞癌[13]、宮頸癌[14]和前列腺癌[15]。Alegre[16]等研究發(fā)現(xiàn)，血清中 TK1 水平的升高是乳腺癌的早期事件，有助于識別癌前病變。Kemik[17]等研究顯示胃腺癌患者血清 TK1 含量明顯高于健康人群，術(shù)前高水平的血清 TK1 預(yù)示著患者的高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)及高死亡率。

胸苷激酶1(TK1)常常用于肺癌的診斷及病情判斷，有學(xué)者檢測非小細(xì)胞肺癌患者TK1及癌胚抗原濃度的變化，發(fā)現(xiàn)95% 的非小細(xì)胞肺癌患者 TK1 濃度均顯著升高，且敏感度顯著高于癌胚抗原[18]。張偉等探討了血清細(xì)胞質(zhì)胸苷激酶1在食管鱗癌診治中的應(yīng)用價(jià)值。方法選取40例食管鱗癌根治術(shù)患者及60例健康體檢者血清TK1的表達(dá)水平。并檢測食管鱗癌患者術(shù)前、術(shù)后1周及術(shù)后1個月血清TK1水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)食管癌組患者TK1水平高于對照組 (P<0. 05);食管癌組TK1陽性率為57. 50%,高于對照 (P<0. 05)。食管癌組患者術(shù)前的血清TK1水平、TK1陽性率均高于術(shù)后 (P<0. 05)。研究結(jié)果認(rèn)為，食管鱗癌患者血清TK1水平及陽性率顯著升高,術(shù)后血清TK1水平及陽性率逐漸下降,血清TK1在食管鱗癌的診斷及手術(shù)療效預(yù)測方面具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值[19]。田果平[20]研究了小細(xì)胞肺癌(SCLC)診斷中血清TK1水平變化分析的價(jià)值，發(fā)現(xiàn)小細(xì)胞肺癌組TK1血清濃度平均值為(3.95±1.23)1.0 ρmol/L,高于對照組(1.21±0.23)1.0 ρmol/L;且觀察組廣泛期患者的TK1血清濃度平均值高于局限期患者,組間比較存在差異(P<0.05)，研究認(rèn)為血清TK1水平變化對小細(xì)胞肺癌(SCLC)患者臨床診斷價(jià)值顯著。 除了作為鑒別診斷及療效判斷的生物標(biāo)記物，Weagel EG[21]等研究發(fā)現(xiàn)，TK1可用于血液系統(tǒng)腫瘤的免疫治療。Wei YT[22]等匯集了10項(xiàng)研究的1 393例肺癌患者，進(jìn)行META分析發(fā)現(xiàn)，TK1的過表達(dá)與肺癌患者更短的總生存期(OS) (OR= 1.881;P=0.001)。而且,TK1過表達(dá)患者的臨床病理特征相關(guān)，包括 (腫瘤大小，年齡，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和TNM分期，該meta分析認(rèn)為，TK1過表達(dá)與肺癌患者的臨床特征及預(yù)后相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，用胸苷激酶1鑒別肺炎旁胸腔積液和結(jié)核性胸腔積液時，AUC=0.57，P=0.449，說明診斷效果不佳，無法有效區(qū)分肺炎旁胸腔積液和結(jié)核性胸腔積液。用胸苷激酶1鑒別結(jié)核性胸腔積液和癌性胸腔積液時，AUC=0.684，P<0.047。當(dāng)胸苷激酶1活性的診斷界值為1.28 pmol/L時，Youden 指數(shù)最大。此時敏感度為0.75，特異度為0.55，Youden 指數(shù)為0.30，提示診斷效果較好，當(dāng)胸苷激酶1濃度≥1.28 pmol/L時，支持癌性胸腔積液診斷，當(dāng)胸苷激酶1濃度<1.28 pmol/L時，支持結(jié)核性胸腔積液診斷。用胸苷激酶1鑒別肺炎旁胸腔積液和癌性胸腔積液時，AUC=0.735，P<0.011，當(dāng)胸苷激酶1濃度為1.27 pmol/L時，Youden指數(shù)最大。此時敏感度為0.75，特異度為0.70， Youden指數(shù)為 0.45。提示診斷效果好，當(dāng)胸苷激酶1濃度≥1.27 pmol/L時，支持癌性胸腔積液診斷， 當(dāng)胸苷激酶1<1.27 pmol/L時，支持肺炎旁胸腔積液。從以上分析可以看出，當(dāng)胸苷激酶1濃度≥1.28 pmol/L時支持診斷癌性胸腔積液診斷，但是當(dāng)胸苷激酶1濃度 <1.28 pmol/L時， 無法判斷胸腔積液屬于肺炎旁還是結(jié)核性。綜上，胸苷激酶1檢測可以用于鑒別癌性胸腔積液和非癌性胸腔積液，但是無法用于鑒別結(jié)核性胸腔積液和肺炎旁胸腔積液，因此無法單獨(dú)應(yīng)用于胸腔積液的鑒別診斷，此結(jié)論與既往文獻(xiàn)研究結(jié)論一致，但診斷界值低于該研究(1.28 pmol/L vs 3.61 pmol/L)，可能與檢測方法不同有關(guān)。因此，可考慮將胸苷激酶與其他生化指標(biāo)，如腺苷脫氨酶、降鈣素原等聯(lián)合以增加診斷效能，這一設(shè)想尚需進(jìn)一步科研工作的驗(yàn)證。

結(jié)核性胸腔積液和肺炎旁胸腔積液均屬于感染性疾病，為病原微生物感染導(dǎo)致的胸膜腔內(nèi)炎癥反應(yīng)，其病理生理過程為變質(zhì)、滲出和增生，導(dǎo)致胸腔積液的產(chǎn)生大于吸收，引起胸腔積液的發(fā)生，但不存在惡性增殖，所以胸苷激酶1含量正常，結(jié)核性胸腔積液與肺炎旁胸腔積液的胸苷激酶1含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，也從側(cè)面證實(shí)，兩種疾病的細(xì)胞增殖程度無明顯差異。癌癥具有惡性增殖性和轉(zhuǎn)移性等特征，正常細(xì)胞通常在G1期死亡，而癌細(xì)胞到 G2/S才發(fā)生死亡[23]，癌性胸腔積液是由于惡性腫瘤，如肺癌，胃癌，腸癌等胸膜轉(zhuǎn)移導(dǎo)致，或者胸膜組織原發(fā)惡性腫瘤，如胸膜間皮瘤導(dǎo)致，無論是轉(zhuǎn)移癌性胸腔積液，或原發(fā)癌性胸腔積液，均導(dǎo)致胸腔積液快速產(chǎn)生，其速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于吸收的速度，因此導(dǎo)致胸腔積液的發(fā)生。胸膜腔內(nèi)癌細(xì)胞的惡性增殖不但導(dǎo)致胸腔積液的發(fā)生，同時導(dǎo)致胸腔積液內(nèi)胸苷激酶1含量升高。

綜上所述，筆者認(rèn)為，胸苷激酶1可用于癌性胸腔積液與非癌性胸腔積液的鑒別，診斷效能較好。TK1在胸腔積液的鑒別診斷方面以及癌性胸腔積液的結(jié)局預(yù)測方面都有一定價(jià)值，但是本研究入組病例數(shù)較少，不排除病原學(xué)假陽性等因素存在，有一定局限性，因此尚待高質(zhì)量/大樣本臨床研究來進(jìn)一步證實(shí)。