第27 屆國際生物學奧林匹克競賽試題實驗4·分子生物學

張 立 陶若婷 張雁云 范六民 戴俊彪

（1 北京師范大學生命科學學院 北京 100875 2 北京十一學校 北京 110000 3 北京大學生命科學學院 北京 100871 4 清華大學生命科學學院 北京 100084）

總分：100 分 時間：90 min

這場考試中， 你將同時為2 個目的完成一項PCR-RFLP 實驗。

·鑒定分析藥物代謝酶（NAT2）的基因型，以決定肺結核（TB）治療藥物口服的劑量。

·未知身份活檢樣本的法醫鑒定。

實驗包括5 個任務：

·任務1：設計RFLP 實驗（17 分）

·任務2：完成RFLP 實驗的操作（44 分）

（注意： 電泳實驗必須距考試開始75 min 內開始。 75 min 后，將不允許跑膠）

·任務3：法醫鑒定未知身份的活檢樣本（9 分）

·任務4：解讀患者基因型（12 分）

·任務5：根據患者基因型確定藥物用量(18 分)請注意以下事項：

·切記，請用鉛筆清楚填寫學生代碼，務必填寫在答題卡第1 頁要求的框內。

·在答題卡上答題（用鉛筆和橡皮擦）。 只有答題紙上的答案才有效。

·請確保您在考試開始時已收到列出的所有材料和儀器。如果材料不全，請立即舉紅牌示意實驗室助理。

·在實驗過程中，請正確使用儀器。任何溢灑的化學品或打碎的儀器都不會補充。但是，如果任何設備出現故障， 請舉起紅牌。 實驗室助理會幫忙，必要時更換一個新設備。

材料和設備

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所有實驗室都提供包括計算器、鉛筆（2B）、橡皮擦和直尺在內的其他工具。

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任務1 PCR-RFLP 實驗設計（17 分）

前言

異煙肼（INH）是治療結核病（TB）的重要藥劑。盡管該療法療效顯著，但仍有治療失敗（無效的治療）和難以處理的副作用（最常見的是肝損傷和有時致死）。 INH 乙酰化被認為是導致藥物引起肝中毒的主要原因。圖1 提供了非誘導肝酶芳香胺的N-乙酰基轉移酶2 型（NAT2）催化INH 乙酰化的主要途徑。 每個個體乙酰化速率恒定，但不同患者的速率不同。 人類群體可根據乙酰化速率分為3 個不同的表型組：慢、中、快乙酰化者。NAT2 慢乙酰化患者被INH 誘導的肝中毒發病率更高。 相反，快乙酰化患者組中更容易發生治療失敗。 通常，快乙酰化組人群的基因型在3 個位置［NAT2*4（C481，G590，G857）］的SNP 都是純合野生型。 中乙酰化人群是雜合子，在一個位置有單個SNP 的突變，即3個 位 置 中 的 一 個NAT2*5 （C481T）、NAT2*6（C590A）或NAT2*7 （G857A）（見圖2a 和2b）。 慢乙酰化人群則有不止一個等位基因突變（可以是一個位置的2 個等位基因，或多個位置的突變）。

圖1 NAT2（N 乙酰基轉移酶）催化的INH 代謝

NAT2 基因型可以通過等位基因特異的聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)實驗測定。

接受相同劑量的INH 的不同NAT2 基因型患者血液INH 濃度的分析表明，慢乙酰化人組的血清中INH 的濃度比快和中乙酰化組高2～7 倍。 因此，NAT2 基因分型，可以幫助實現INH 劑量使用的個性化。

在本實驗中， 你將收到從3 個結核病患者P1、P2 和P3 全基因組DNA 中提取的NAT2 基因的PCR 產物，以及從這3 個患者提取的未標明的活檢標本PCR 產物X、Y 和Z。你需要設計和實施PCR-RFLP 實驗， 以確定每個患者的NAT2 基因型，并且鑒定其活檢標本。 在PCR 產物上，用適當的限制性內切酶（RE）鑒定基因型。 用所獲得的數據，確定活檢X、Y 和Z 的身份。 最后，確定患者P1、P2 和P3 最適宜的INH 劑量。

圖2（a）

在答題卡上的圖中完成期望的RFLP 結果模式（pattern），請用鉛筆作答，畫出4 個NAT2 等位基因NAT2*4 （野生型），NAT2*5（481T），NAT2*6（590A）和NAT2*7（857A）限制性酶切完全消化PCR 產物所期望產生的條帶。 雜合子的例子已經提供。

圖Q1.1

本項任務中， 你需要進行共12 管樣本的RFLP 反應，鑒定3 位患 者（P1、P2、P3）和3 個活體樣本 （X、Y、Z） 的野生型、NAT2*5 等位基因（標為a）、NAT2*7 等位基因（標為b）。 請在每個PCR 管中，使用7.0 μg DNA，限制性緩沖溶液，需要使用RE 時使用l.0 μL。

問題1.2 （5 分）

請設計患者（P1～P3）和樣本（X～Z）的限制性消化或者NAT2 基因型分析，在l0 μL 的體系中。請在答題卡上完成下表。

表Q1.2

任務2 完成RFLP 實驗操作（44 分）

注意：

·電泳時，你只操作使用FlashGel 系統的2 個部件，膠盒（Cassette）和電泳槽（Dock）（圖3），而電源和攝像機由實驗室助理操作。 為達到最佳效果，加樣前，用去離子水先沖洗加樣槽。 觀察條帶時，關燈（用電泳槽Dock 上的開關），并戴護目鏡。

·你可以再要一塊膠，但是會罰去20 分。

·使用加樣槍加樣前， 用離心機短時間離心所有試劑 （務必在對側放置相應離心管以平衡離心機，如果只有一個管，用空管平衡）。

圖3 FlashGel［8］水平電泳系統（A）膠盒Cassette（B）膠槽Dock（C）照明開關（D）相機（E）電源

該實驗過程包括2 個階段：PCR-RFLP 消化和電泳。

第1 步（準備RE 消化的離心管）：用細尖記號筆將12 個微管（Microtube）標記為P1a，P1b，P2a，P2b，P3a，P3b，Xa，Xb，Ya，Yb，Za，Zb，對應于3 名患者（P1，P2 和P3）和3 個活檢樣本用Kpn I 或者Bam HI 消化后的基因組DNA 的PCR 產物。

第2 步（限制性酶消化混合物的制備）：根據你設計的限制性酶消化反應（你答題卡上的表Q1.2），在步驟1 標記你的微管中制備限制性酶消化的混合物。用加樣槍在管中輕輕吸加樣本進行攪拌，或者用手指輕彈管底。制備混合物時，切勿污染樣品（每次操作使用一個新槍頭）。 用適合的適配器離心沉降樣品（離心前請平衡離心管）。 制備過程中和離心后，請總是將離心管置于冰上。

第3 步（溫育消化反應，準備預制凝膠）：所有的離心管都準備好后，從冰中取出，置于你顏色編碼的泡沫浮架上，在指定給你的37℃水浴中（位于座位后面）孵育5 min。孵育5 min 后，請務必取回自己的樣本。

在37℃孵育時， 你可以準備之前參觀實驗室時看過的膠塊（預制凝膠），步驟如下：

·用剪刀剪開包裝的一側，小心取出膠塊。

·取出膠塊的白色封條（但不要移除側面的透明封口）。

·用洗瓶使用去離子水沖洗加樣孔（務必沖洗所有加樣孔）， 傾斜膠塊， 排去多余液體，用Kimwipe 紙吸去多余液體（不要直接吸加樣孔）。

·將膠塊加入電泳槽（如果需要幫助，請舉起紅卡）后可以準備上樣。

第4 步（RE 滅活，停止消化反應）：5 min 的限制性酶消化結束后，取回自己的離心管，將其移至附近的80℃加熱裝置（如有必要，用紙巾吸干微管外多余的液體）孵育5 min。

第5 步（DNA／PCR-RFLP 產物染色）：經過80℃的孵育后，離心冷卻，并將試劑離心至管底。在每個離心管中加入2.5 μL DNA 染色染料（標記為D）。充分混合,然后再次使用微型離心機輕微離心一次。

第6 步（電泳上樣）：12 個樣品（P1a - Zb）和100 bp ladder 溶液（標記M）分別上樣5 μL（注意：每個泳道體積上限是5 μL，上樣不要超過5 μL）。 請務必將槍頭小心置于加樣孔上方，輕輕加入樣品，不要灑出。 請嚴格按照以下順序，依次加入樣品至各泳道（從左側開始，加樣孔在離你遠的那端）。

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第7 步（運行電泳）：加樣完成后，舉起綠卡。實驗室助手將啟動電泳。 電源的電壓應設為200 V。大約7～8 min （當Ladder M 最快的條帶已經跑過凝膠2/3 處）后，再次舉起綠卡，通知助手斷開（關閉）電源。

第8 步（記錄凝膠數據）：助手將電泳槽從電源盒斷開。 電泳槽插上電源插座，將燈打開。 觀察凝膠（帶護目鏡），并用鉛筆在答題卡的圖Q2.1 上畫出觀察到的各條帶 （注意打印好的ladder M的標度， 畫出的任何和下一步將制備的膠照片不匹配的泳道或條帶都不能得分）。

第9 步（拍攝凝膠）：完成繪圖后，在標簽貼紙上標明自己的學生號（Student ID），附在你膠塊的框上（紅色的部分）。 舉起綠卡，將帶膠塊的電泳槽交給實驗室助理。助理將會為凝膠拍照，并將照片附于你答題卡上（注意，沒有按照第6 步中順序加樣的結果將不計分，但是可以用于后面的題）。

問題2.1 畫出凝膠圖。 （18 分）

問題2.2 將照片貼在答題卡上（26 分）

任務3 活檢樣品的法醫鑒定（9 分）

問題3.1 （9 分）

根據任務2 中3 個患者（P1～P3）樣品，和3個活檢標本的PCR-RFLP 譜， 對比匹配樣本X、Y、Z 分屬哪位患者，在答題卡的表格中填入答案。

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注意：任務4 和任務5 答題時，如果你未能在任務2 中成功分析出患者P1、P2、P3 的基因型，你可以根據活體標本（X、Y、Z）的結果譜進行推測，在要求填入“患者”的欄目填入X、Y、Z，但是每次替代都會被扣除1.5 分。

任務4 患者的基因型解讀（12 分）

問題4.1 （9 分）

根據你Kpn I（NAT2*5 或C481T）和Bam HI（NAT2*7 或G857A）消化后，PCR-RFLP 的結果，推斷3 名患者的基因型， 在答題卡上填寫完成表格。 基于TaqⅠ消化后NAT2*6（G590A）位點3名患者的基因型已經給出。

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問題4.2 （3 分）

基于你對3 名患者基因型的判斷（問題4.1），推斷他們乙酰化的表型， 請在答題卡上相應方塊內打勾（√）。

A.患者P1 B.患者P2 C.患者P3

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任務5 根據患者基因型決定用藥劑量（18 分）

前言：2015 年，Jung A J 和他同事 （Journal of Drug Design，Development and Therapy；9：5433-8）研究了206 例接受標準劑量INH 治療 （5 mg/kg 體重，通常每天用藥300 mg INH）的肺結核患者，發現在快乙酰化患者用藥后2 h 血清中，INH 含量顯著低于慢乙酰化組。 包含年齡、 性別、 體重和NAT2 基因型的多重線性回歸分析表明，NAT2 和體重獨立影響INH 濃度（P＜0.001），而其他因素不影響INH 濃度（P＞0.05）。

根據回歸分析，INH 濃度的最佳預測公式如下：

血 清INH 濃 度（mg/L）=13.821-0.1×（體 重，kg）-2.273×（高活性NAT2 等位基因的數量，0，1，2）（公式1）

在此公式中， 高活性NAT2 等位基因的數量（0，1，2），分別相應于3 種表型，即慢、中和快乙酰化者。

INH 最有效的抗結核治療，是用藥2 h 后，血清中INH 濃度降至3.0～6.0 mg/L 的范圍內。 根據圖4中藥物標簽上顯示的INH 的濃度， 請判定適合于P1、P2、P3 3 位患者的處方。根據下面2 個步驟作答（問題5.1 和5.2）。 假設3 名患者體重都是70 kg。

問題5.1 （6 分）

假設， 每名患者服用300 mg INH 的日劑量，根據公式1 和患者的基因型估算用藥2 h 后P1、P2、P3 血清中INH 的濃度。 完成答題卡上的表格（結果保留3 位小數）。

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問題5.2 （12 分）

請根據每位患者相應的NAT2 基因型， 決定他們每天最少需要吃多少片藥（見圖4），以保證抗肺結核治療的最佳效果。 填寫完成答題卡上的表格（請填寫整數）。

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（待續）