哈密瓜內生菌分離實驗應用于中職生物學教學的嘗試*

令利軍 張 璽 鄭生岳 史苗霞 馮娟娟 焦正龍 李子彬

（1 西北師范大學生命科學學院 甘肅蘭州 730070 2 甘肅農業職業技術學院農業技術系 甘肅蘭州 730020）

0 引言

植物內生菌（Endophyte）通常是指存在于高等植物組織和器官內的真菌、細菌及酵母菌。其在植物體內具有相對穩定的生存空間， 可以在植物體內獨立的繁殖和傳遞。 近年來研究結果表明內生菌在植物體內具有生物防治的生態位， 具有促進植物生長、抗病蟲害、加強宿主的抗逆境等功能。基于以上研究基礎， 植物內生菌作為當前生物防治資源的優良材料， 已經逐漸成為國內外的研究熱點， 從植物中分離出的內生菌是獲得天然產物及開發新藥物的潛在資源［2-3］。

哈密瓜（Cucumis melo var. saccharinus）隸屬于葫蘆科，又稱雪瓜、貢瓜等，是一類優良的甜瓜品種［5］。 為了解哈密瓜內生菌的生物多樣性，并對其內生菌進行分離鑒定， 從而進一步研究內生菌與宿主的關系及為內生菌的開發應用奠定基礎［4］。

1 哈密瓜內生菌分離與純化的實驗流程及教學活動組織

1.1 哈密瓜內生菌分離與純化的實驗流程 樣品的制備→表面消毒→內生分離、 純化→形態觀察→分析結果→種屬確定［1］。

1.2 教學活動組織 中職教育的最終目標是培養應用技能型人才， 實踐能力是最為重要的環節之一。實踐教學對學生技能的培養有著深遠意義，通過實驗教學， 學生親自動手實踐不斷加深理論知識，并將掌握的理論知識升華為操作技能。此次教學設計可將班級學生按小組形式進行實驗，每小組6～8 人，組長負責制［10-11］。 由這6～8 人共同查閱文獻，確定實驗方案，其中2 名學生準備實驗材料和儀器；1 名學生做好實驗的記錄工作；實驗過程中每一步驟均由2 名學生輪流合作完成。 實驗全程由教師參與指導。

2 哈密瓜內生菌分離與純化教學實驗步驟

2.1 材料與試劑 冷藏條件下的哈密瓜（4℃）；NA、PDA 和YPD 培養基［4］。

2.2 儀器與設備 電子天平（HTP-312）；生化培養 箱（Blue Pard）；超 凈 工 作 臺（BSC-1300ΙΙA2）；電 熱 鼓 風 干 燥 箱 （GZX-9030MBE）； 柜 型 冰 柜（FCD-196SE）；壓力蒸汽滅菌鍋（DSX-280B）；超聲波清洗器（KQ5200B）。

2.3 方法

1）樣品的采集與制備。選取生長狀況良好，表面無機械損傷，成熟的瓜作為樣品，并放置4℃冷藏。

2）表面消毒。 第1 步，取樣。 在超凈工作臺里分別在哈密瓜的不同部位（皮層，淺層，深層）取1 cm2的組織塊若干，將組織塊消毒處理。 用無菌水沖洗3 遍，第3 遍的無菌水涂布于培養基，作為消毒對照。

第2 步，制備菌懸液。在超凈工作臺里用滅過菌的研缽將組織塊搗碎、研磨。 按需加入無菌水，按比例分別制備稀釋倍數為10-3、10-4、10-5的菌懸 液 備 用［6］。

第3 步，涂布。在超凈工作臺里將備用菌懸液分別在NA、PDA 和YPD 培養基進行涂布， 淺層、皮層和深層的菌懸液各涂布于3 種培養基， 進行編號。 NA 培養基在37℃下培養1～2 d，PDA 和YPD 培養基在28℃下培養3～5 d。

第4 步，記錄實驗結果，并觀察菌落形態特征。

第5 步，參考《酵母菌特征與鑒定手冊》、《常見細菌系統鑒定手冊》和《真菌鑒定手冊》，根據菌落的形態特征，生長速度，邊緣形態，顏色和大小，是否透明等方面，進行確定。

3）樣品的分離。 待培養基中長出肉眼可見的菌落時，根據菌落的顏色差異及形態特征，挑取不同的菌落接于新的培養基上，進行編號，NA 培養基在37℃下培養1～2 d，PDA 培養基和YPD 培養基在28℃下培養3～5 d， 觀察菌落的生長速度和形態特征，記錄觀察結果。

4）樣品的純化。 根據菌落形態特征選取合適的培養基，重復劃線操作，直至純化為單菌落，并進行編號，NA 培養基在37℃下培養1～2 d，PDA培養基和YPD 培養基在28℃下培養3～5 d，觀察菌落形態特征，記錄觀察結果。

5）菌種的保藏。采用甘油保存法：將要保存的菌種接種于LB 液體培養基，培養至對數生長期，即肉眼能看見培養體系內渾濁即可。 將甘油稀釋至濃度為30%。 在無菌條件下將菌液與30%濃度甘油1∶1 等體積混合于離心管中， 甘油的最終濃度為15%。 可于-80℃冰箱內保存2 年。

3 結果與分析

內生菌分離的結果：實驗中均利用菌懸液涂布法，對哈密瓜的皮層、淺層、深層的內生菌進行分離，分別在皮層分離出菌落形態不同的4 株，在淺層分離出菌落形態不同的2 株，在深層分離出菌落形態不同的2 株。 分離出的8 株內生菌中，細菌有6 株，占總菌數的75%；酵母有2 株，占總菌數的25%（表1、圖1，圖1 見封四）。

表1 哈密瓜內生菌菌落形態特征

4 實驗結果分析與討論

整個實驗結束后由教師組織學生按小組討論， 再由組長將討論結果整合后向全班學生做匯報。 討論主要圍繞以下2 個方面進行：第一，圍繞實驗所獲得的菌種， 引導學生討論植物中存在哪幾類內生菌， 這些內生菌與植物宿主的關系及這些內生菌有哪些應用價值；第二，實驗結果不佳的小組， 由小組成員共同分析討論是哪個環節出了問題，如何改進實驗方案，最后由教師總結評價并給出標準化實驗方案以供學生參考。

哈密瓜內生菌的分離過程中， 要對哈密瓜的表面和組織塊滅菌，并做好實驗對照，即用第3 遍沖洗消毒后組織塊無菌水進行涂布。 在滅菌時不但要將表面的細菌殺死， 還要確保不能傷到內部的細菌，整個實驗在無菌的條件下進行。

本實驗表明，哈密瓜皮層、淺層和深層組織中均存在內生菌，且內生菌具有一定的多樣性。內生菌由于與宿主植物長期共處， 進而形成了一種復雜、特殊的關系，它們有的是互利共生關系，而有的是無害或微害寄生關系，2 種關系可隨多種因素變化而相互轉化［12］。 內生菌在生物制藥方面具有較大的應用前景， 利用內生菌生產生防菌劑代替化學農藥等［13］。

5 學生收獲

5.1 專業素養方面 學生通過實驗，對內生菌的相關知識產生了濃厚的興趣， 初步掌握了內生菌分離與純化的操作步驟及關鍵環節和注意事項，能對實驗結果進行分析討論， 能找出實驗失敗的原因及解決問題的方法［8］。

學生對使用滅菌鍋、 超凈工作臺等實驗儀器設備操作嫻熟， 掌握了如何制備培養基和菌懸液方法，提高了學生對實驗現象的觀察，數據分析處理等專業素養。

5.2 情感態度價值觀方面 培養學生自主學習新知識、新技術；能通過各種媒體資源收集所需信息； 能獨立制定工作計劃并實施； 能獨立進行調查、對比、分析；具有團隊協作、創新能力及持之以恒的精神等［7］。