第27 屆國際生物學奧林匹克競賽試題實驗3·生物化學與微生物學

范六民 戴俊彪 張 立 陶若婷 張雁云

（1 北京大學生命科學學院 北京 100871 2 清華大學生命科學學院 北京 100084 3 北京師范大學生命科學學院 北京 100875 4 北京十一學校 北京 110000）

總分：100 分；時間：90 min。

本次考試包括下列3 個實驗

實驗1：蛋白的表達、純化和鑒定（40 分）

實驗2：咖啡提取物的抗氧化活性（30 分）

實驗3：乳酸發酵（30 分）

請注意以下內容：

·請把答案填寫在答題卡上。

·請檢查所有的材料和設備， 確定你已經收到所有列出的材料和設備。

·實驗過程中，請正確使用儀器設備。任何濺灑的試劑和損壞的儀器都無法再次獲得。

·實驗1 中的凝膠電泳不得在最后30 min內完成，建議你首先開展實驗1。

·在實驗2 中， 請注意獲取分光光度計上的讀數，否則無法回答該問題。

材料和設備

設備和用于3 個實驗的材料：

名稱 數量P1000 微量移液器（100～1 000 滋L） 1件P200 微量移液器（20～200 滋L） 1件P20 微量移液器（2～200 滋L） 1件用于P1 000 微量移液器的槍頭 1盒用于P20 和P200 微量移液器的槍頭 1盒去離子水（dH2O） 1瓶微量試管（EP 管）架 1件用于液體廢物存放的圓形塑料容器（廢液） 1件用于固體廢物存放的方形塑料容器（固體廢物） 1件計時器 1件手套 1副衛生紙 1盒膠1管學生條碼標簽 5件紅牌 1件綠牌 1件計算器 1件記號筆 1件防護眼鏡 1件

用于實驗1：

名稱 數量SDS-PAGE 凝膠電泳槽和電源 1套凝膠電泳梳子 1件凝膠容器（含學生代碼） 1件1.5 mL 離心管 10 件裝配有聚丙烯酰胺凝膠盒的凝膠電泳槽 1件包含2× SDS-PAGE 上樣緩沖液的品紅色離心管（緩沖液） 1件裝有8 滋L 蛋白質marker 的黃色微離心管（M） 1件裝有30 滋L 細胞，不含有IPTG 的離心管（NO_IPTG） 1件裝有30 滋L 細胞，含有IPTG 的離心管（IPTG） 1件裝有IPTG 誘導后，30 滋L 細胞裂解液離心后所得沉淀的離心管（Pellet） 1件裝有IPTG 誘導后，30 滋L 細胞裂解液離心后所得上清的離心管（Super） 1件裝有30 滋L 純化后蛋白質的微量離心管（Puri-P） 1件包含40 mL 的SDS-PAGE 染色溶液的Falcon 試管（綠帽）（STAIN） 1件

用于實驗2：

名稱 數量帶有學生代碼的96 孔板（請勿觸碰板的底部） 1件包含300 滋L，1 mg/mL 抗壞血酸溶液的藍色離心管（AA） 1件包含300 滋L，5 mg/mL 咖啡提取物的藍色離心管（CC） 1件包含15 mL，0.2 mnol/L DPPH 溶液的棕色瓶（DPPH） 1件

用于實驗3：

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實驗1 蛋白質的表達、純化和分析（40 分）

介紹：H 和B 蛋白質是氣單胞菌（Aeromonas hydrophilas）的2 個重要蛋白。為了研究它們，科學家希望在大腸桿菌中共同表達它們。因此，B 基因和H 基因分別被克隆到表達載體P1 的多克隆位點1（MCS-1）和多克隆位點2（圖1.1）。 所得到的載體P1-b-h 被轉化到大腸桿菌中，利用IPTG 誘導蛋白表達。然后通過親和層析，利用鎳柱純化帶有6xHis 標簽的蛋白質。 最后通過SDS-PAGE，針對蛋白質分子量的大小， 對純化后所獲得的蛋白進行分析評價。 注意：H 的分子量比B 小。

圖1.1 表達載體的P1 的總覽圖

帶有P1-b-h 殼的大腸桿菌單菌落在50 mL的LB 培養基中，37℃培養至OD600為0.6。 為了分析重組蛋白的表達和純化， 科學家已收集以下這幾個細胞和蛋白樣品：

·NO-IPTG：1 mL 培養液被轉移到一個培養管中，在20℃生長16 h（OD600=2.4）后離心。 棄去上清液后將細胞沉淀重新懸浮于50 μL H20 中，加入50 μL 2× SDS-PAGE 上樣緩沖液混合，得到100 μL 樣品。

在剩余的49 mL 培養液中，添加IPTG。在20℃培養16 h，誘導蛋白表達。

·IPTG：取1 mL IPTG 誘導后的菌液（OD600=1.4）離心。 棄去上清液，將細胞沉淀重新懸浮于50 μL H20 中，然后加入50 μL 2× SDS-PAGE 上樣緩沖液混合，得到100 μL 樣品。

將剩余48 mL 培養液離心，棄去上清液并將細胞沉淀重懸于2 mL 緩沖液中；將細胞懸浮液裂解，并隨后離心分離。 上清液和沉淀均需要收集。

·Pellet（沉淀）：將IPTG 誘導后細胞裂解液離心所得的沉淀物重新懸浮于2 mL 緩沖液中，然后加入2 mL 2× SDS-PAGE 上樣緩沖液 （沉淀儲存液）混合。

·Super（上清）：將10 μL，IPTG 誘導后的細胞裂解物中得到的上清液10 μL 2× SDS-PAGE上樣緩沖液混合。

·Puri-P（純化后的蛋白）：剩余上清液加入到用于蛋白質純化的鎳柱。 純化后的蛋白質用2 mL 洗脫緩沖液進行洗脫。取10 μL 洗脫所得的蛋白質與10 μL 2× SDS-PAGE 上樣緩沖液混合。

將所有用于SDS-PAGE 分析的樣品在100℃煮沸5 min。

設計SDS-PAGE 實驗，分析蛋白的表達。

用于SDS-PAGE 分析的總蛋白標準終濃度必須相當于5×l06個細胞／μL。 首先，計算每個樣品中的細胞濃度。 OD600值為1 相當于知8×108個細胞／mL。 請考慮操作過程中各樣品的稀釋度。

問題1.1 （6 分）

計算并在下表中填寫樣品的體積（μL）。 用一位小數。

管1 管2 管3 管4 管5 管6樣品 蛋白marker NO-IPTG IPTG Pellet SuerPuri-P儲液（μL） 5 14.9 14.9 15 H2O（μL） 5 12.5 12.5 12.5 2× SDS-PAGE 緩沖液 10 12.6 12.6 12.5總體積（μL） 20 40 40 40 40 40

實驗步驟

·根據上面的表格， 準備在提供空離心管所有SDS-PAGE 樣品。 通過上下吹打4～5 次混勻各樣品。

完成此步驟后，請舉起綠卡。助手將引導你去上樣區，并幫助將你的學生代碼粘貼到電泳槽上。

·將每個樣品點樣20 μL 到SDS-PAGE 膠上，必須按管1～6 的順序上樣。 為上樣，請使用P20移液器和槍頭吸取20 μL 樣品， 并小心地將槍頭置于加樣孔的頂部（1.2）。

圖1.2 在SDS 凝膠樣品裝載

·實驗助理將運行SDS-PAGE 20 min。 他會告知你設置定時器20 min。

在SDS-PAGE 進行過程中你可以做另一項實驗。 20 min 后， 請舉起綠卡， 通知助理將SDSPAGE 凝膠返還給你。

·如圖所示（圖1.3），將塑料盒中的SDS-PAGE凝膠用凝膠梳子打開，將凝膠放到膠容器中。

圖1.3 從凝膠盒中取出SDS-PAGE 凝膠操作示意圖

步驟1）將梳子插入凝膠盒各個槽口，轉動梳子把凝膠盒撬動。從頂部的槽口開始，沿著盒的每一側向下移動。

步驟2）當兩側打開后，將梳子放置在斜邊底角板之間的45 度角，用力扭轉。

步驟3）輕輕將2 個盒分開。

·在凝膠容器搖加入40 mL 的染色溶液（STAIN），放置在搖床上轉動染色10 min。

·將凝膠容器中的染色溶液倒入廢液桶，使用去離子水清洗凝膠3 次。

完成上述操作后，舉起綠卡，請助理幫助拍取凝膠照片。

問題1.2 SDS-PAGE 結果（10 分）

得到SDS-PAGE 凝膠照片后， 將其粘貼在答題卡指定的地方。

問題1.3 （4 分）

基于圖1.4A 提供的資料，將至少5 個標記蛋白，根據它們的分子量和相對遷移的Rf 值，在答題卡規定的圖形文件上取點作圖 （Rf=蛋白質遷移距離／染料前端遷移距離）。

圖1.4 蛋白marker（A）和方格紙（B）

問題1.4 （4 分）

利用問題1.3 中的圖標及SDS-PAGE 膠圖，分別估算蛋白H 和B 的分子量。

問題1.5 （4 分）

基于SDS-PAGE 結果， 判斷下列陳述的對和錯。 在答題卡上用“√”表明正誤。

A. H 蛋白在含有IPTG 的LB 培養基中是過表達的

B. B 蛋白在鎳柱結合緩沖液中是完全可溶的

C. H 和B 蛋白相互作用

D. 大部分的重組蛋白被結合到了鎳柱上

問題1.6 （4 分）

根據P1 表達載體（圖1.5）的詳細酶切圖譜，判斷下列陳述的對錯。 在答題卡上用“√”表明正誤。

以下陳述正確的打“√”，錯誤的打“×”。

A. Sal I 和Bam HI 可以用于將b 基因插入到MCS-1

B.為了能同時進行表達，基因h 和b 應以相同的轉錄取向進行克隆

C.為了能同時進行表達，基因h 和B 要位于同一開放閱讀框中

D.為了維持質粒在細菌中的穩定存在，必須在培養基中添加氨芐青霉（ampicillin）

為了表征H 和B 蛋白的寡聚狀態，準備如下3 個蛋白樣品：1）H 蛋白；2）從上述實驗中得到的H 和B 蛋白；3）B 蛋白。 樣 品1 和樣品2 是透明的，但樣品3 中大部分蛋白質發生沉淀。 將樣品1和樣品2 分別通過凝膠過濾柱。 所獲得的蛋白分離譜如圖1.6A 所示。不同大小參照分子在凝膠過濾柱上的分離如圖1.6B 所示。

圖1.5 P1 表達載體詳細的限制性圖譜

圖1.6 H 和B 蛋白的凝膠過濾分析

問題1.7 （4 分）

計算樣品1 和樣品2 中， 蛋白所對應凝膠過濾峰的相對大小，填寫在下表中。

樣品 分子量（kDa）樣品1 中觀察到的峰樣品2 中觀察到的峰

問題1.8 （4 分）

判斷下列陳述的正確與錯誤。 在答題卡上用“√”表明正或誤。

A. H 蛋白以單體的形式存在

B. H 和B 可能以異源二聚體形式存在

C. H 蛋白有助于B 蛋白的穩定存在

D. 在非變性凝膠過濾柱分析中，一個蛋白質的保留時間和它們的分子量大小成正比

實驗2 咖啡提取物的抗氧化活性（30 分）

介紹：生物氧化產生活性氧自由基，可造成細胞嚴重損壞。抗氧化劑是能清除自由基，從而抑制氧化反應的分子。 抗氧化劑包括還原劑如硫醇化合物，抗壞血酸及酚醛等。咖啡通過烘焙咖啡豆制備，是抗氧化劑的一個潛在來源。

在2，2-diphenyl-l-picrylhydrazyl（DPPH）清除實驗中，DPPH 的量被不斷減小， 從而失去其紫色。SC50值（清除能力）通常用于抗氧化活性的評估。 此值表示清除50%的DPPH 自由基所需樣品的濃度。

DPPH 吸收率可以在517 nm 波長處測定。 假設空白的吸光度可忽略不計。 對照組（無清除劑，Ac）和樣品（As）的吸光度將用于計算不同濃度樣本的清除率（SC%）：

SC（%）=（Ac-As）×l00／Ac

根據一系列樣品中不同濃度和相應的清除百分比的對數，可以做圖并從中計算獲得SC50值。

本實驗將研究一個越南咖啡品種（Coffea canephora）的抗氧化活性。 咖啡豆粉混合物（1 g）在80℃下，懸浮于去離子水中30 min，然后過濾。 加入去離子水，將萃取液的總體積定量為200 mL。

實驗步驟和問題：

圖2.1 96 孔微量培養板

上面的96 孔微量培養板可用于開展系列稀釋實驗。 微孔板上孔的位置由一個代表行的字母（A～H）和一個代表列的數字（1～12）表示。

·使用微量移液器制備4 個抗壞血酸溶液（AA1-AA4， 分別位于A1-A4 孔中） 和4 個咖啡萃取液溶液（CC1-CC4，分別位于A6-A9 孔中）。每個溶液都是2 倍稀釋。 抗壞血酸和咖啡提取液最低濃度分別是0.025 mg/mL 和0.625 mg/mL。每個孔中的溶液在稀釋前都是200 mL。

注意：如果在加樣過程中不慎發生錯誤，可以將抗壞血酸溶液和咖啡萃取液溶液分別放置到孔H1-H4（AA1-AA4）和H6-H9（CC1-CC4）。

問題2.1 （4 分）

將你準備抗壞血酸和咖啡提取物的稀釋計算填入下表中。

稀釋液 AA1 AA2 AA3 AA4 CC1 CC2 CC3 CC4用于稀釋溶液的體積（滋L）H2O（滋L）的體積濃度（mg／mL） 0.025 0.625

·從行A 各個孔內的抗壞血酸溶液和咖啡提取物溶液中分別移取20 滋L， 放置到行B、C 和D的相應孔內。如果在此步驟中不慎發生錯誤，可在行E、F 和G 中重復上述操作。

·在孔B11、C11 和D11 中各加入20 滋L 水。

·在步驟2 和3 中準備的孔內，各加入180 滋L的DPPH 溶液。

·將蓋子蓋好96 孔板，在室溫下孵育10 min。請設置定時器計時。

完成此步驟后，請舉起綠卡。請助理幫助你用酶標儀測定吸光度，并返回你打印好的輸出數據。

問題2.2 （5 分）

計算抗壞血酸和咖啡萃取物濃度的對數值（log10），并填入答題卡上的表格內（所有數字四舍五入至2 位小數）。 你可根據下列步驟，使用計算器計算對數值：

·按ON 鍵，打開計算器。

·按4 個鍵：“SHIFT”鍵、“CLR”鍵、“2”鍵、“=”鍵返回到計算模式。

·按“log”鍵。

·輸入數字。

·按“=”鍵。

計算每個稀釋的平均吸光度、 每個樣品的清除率并填入下表。

溶液 對照AA1 AA2 AA3 AA4 CC1 CC2 CC3 CC4 Log10 濃度（mg／mL）平均吸光度SC%

問題2.3 （5 分）

Log10 濃度（mg／mL）

使用計算值， 在答題卡上給出的網格線中繪制清除率對應抗壞血酸濃度的對數（log10）的線性曲線。

問題2.4 （5 分）

計算抗壞血酸和咖啡提取物的SC50值，并填入答題卡上表格中（你可以利用問題2.3 中的格子對咖啡萃取液作一條線性曲線，但該曲線并不算分）。

抗壞血酸 咖啡萃取物SC50

問題2.5 （3 分）

使用相同的方法， 某2 個咖啡品種提取物的SC50的值如下：

咖啡提取物 SC50 X 3.8 mg／mL Y 2.6 mg／mL

比較包括本實驗中咖啡豆（Z）的抗氧化活性，依據從強到弱的順序， 把不同類型的咖啡豆填入下表的空格處。

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問題2.6 （4 分）

假設你在實驗中發現不同稀釋度的咖啡提取物和DPPH 混合物的吸光度非常接近， 差異可忽略不計。 請判斷下列陳述是正確還是錯誤，用“√”表明。

A.稀釋后的咖啡提取物的抗氧化活性可以忽略不計

B.為了更準確地測定抗氧化活性，需要利用更高濃度的樣品進行另外的實驗

C.咖啡提取物中存在的抗氧化酶的活性導致了上述結果

D.如果孔中存在NADH 污染，其結果將類似于上述假設

問題2.7 （4 分）

一個學生使用和你一樣的方法（方法A）測定了一個樣品的抗氧化活性。與此同時，他又使用了另一不同方法（方法A*）進行測量。他所得的結果如下：

方法A 方法A*SC50（mg／mL） 1.95 3.9

下列哪些變化可能導致更高的SC50值？ 請判斷下列陳述是正確還是錯誤，用“√”表明。

A.該學生在方法A*中可能使用了0.1 mm 的DPPH

B.該學生在方法A*中可能使用了10 μL 的樣品

C.加入DPPH 后，該學生將96 孔板孵育的時間可能比方法A 中的短

D.該學生可能使用了對抗氧劑更好的溶劑

實驗3 乳酸發酵（30 分）

介紹：近日，科學家分離出越南傳統發酵芥菜同型酸乳酸桿菌菌株（Lactobacillus sp. VN156）。在該實驗中， 乳酸桿菌VN156 在MRS 培養基中生長。 培養基的初始pH 為5.6。 在培養過程中的不同時間點取樣， 測定細菌在600 nm 的光密度（OD）（圖3.1）。 樣品A0、A2、A3 和A5 是所收集菌液的上清液，將用于分析乳酸的濃度。

圖3.1 乳酸桿菌VN156 的生長曲線

問題3.1 （3 分）

假設圖3.1 表示生長的真實過程。 計算乳酸桿菌VN156 在指數生長期的增代時間（h），將數值填入答題卡中。

問題3.2 （3 分）

如果將1 mL，培養9 h 后的菌液稀釋到新鮮的MRS 培養基中，計算培養6 h 后的細菌細胞數量，記錄在答題卡中。

pH 計的校準。

使用便攜式pH 計（圖3.2）測量pH 值。

圖3.2 便攜式pH 計

步驟1）按照圖3.3 中以下步驟校準pH 計。

·撥動ON／OFF 按鈕，打開pH 計。

·取下保護蓋，用清水沖洗電極尖，輕輕地用紙巾擦干。

·將電極頭部浸入pH 值7.01 的緩沖溶液中。 確保電極末端完全浸沒在溶液中（約2 cm 的末端在溶液中）。 等待讀數穩定。

·用螺絲刀， 輕輕旋轉pH7 微調螺絲， 直到屏幕上顯示pH 值為7.01。

·用水沖洗pH 電極，輕輕地用紙巾擦干。

·將電極頭部浸入pH4.01 的緩沖溶液中。等待讀數穩定。

·用螺絲刀，輕輕旋轉pH4／10 微調螺絲，直到屏幕上顯示pH 值為4.01。

·校準完成。

·注意：如果你關閉pH 計，再次打開使用前應重新校準。

圖3.3 校準pH 計

乳酸滴定：滴定是一種分析技術，可對溶解在溶液中的特定物質（分析物）進行定量測定。 它基于添加到溶液中、濃度已知的分析物和試劑（滴定劑）之間完全化學反應。 在這一部分實驗中，將通過滴定方法，用0.1 mol/L 的氫氧化鈉確定樣品中的乳酸濃度，如圖3.4 所示。

圖3.4 滴定裝置

問題3.3 （2 分）

根據問題3.2 的結果計算所需樣品（mL）和水（mL）的體積，并填入下表中。

培養時間（h）樣品稀釋因子樣品體積（mL）去離子水的體積（mL）總體積（mL）0 A0 2 30 6 A2 5 30 9 A3 10 30 15 A5 20 30

·根據你的計算，在100 mL 的燒杯中對每個樣品配制稀釋液。每個樣品準備2 個重復樣品。請使用25 mL 的量筒移取去離子水，使用微量移液器和10 mL 的量筒中移取樣品。

·將一個磁性攪拌棒小心地放入稀釋的樣品溶液中。 夾緊pH 計，讓電極末端處于溶液中（約2 cm 的末端浸沒在溶液中）， 同時保證在攪拌的過程中攪拌子不會碰到pH 電極。 開始進行緩慢攪拌并記錄0.1 mol/L NaOH 溶液的起始體積。

·小心擰動滴定管的活塞，讓NaOH 溶液從管中緩慢滴入燒杯里的樣品中。 當pH 樣品變為中性（6.95～7.05）時，停止加入NaOH。 記錄0.1 mol/L NaOH 溶液的剩余終體積。

·每次滴定完成后， 小心地從溶液中取出pH電極，用清水沖洗。用鉗子取出攪拌子并用水沖洗。

·針對每個樣本，重復步驟2～5。

問題3.4 （9 分）

記錄用于每個樣品滴定的0.1 mol/L 氫氧化鈉的體積，記錄在下表中。

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問題3.5 （10 分）

計算滴定每個樣品，30 mL 儲備所需0.1 mol／L NaOH 的平均體積。 計算每個樣品中乳酸菌濃度。在下表中記錄所有數據。

培養時間（h） 樣品 滴定30 mL 儲備樣品用0.1 mol／L NaOH 的體積（mL）乳酸產量（g／L）0 A0 6 A2 9 A3 15 A5

問題3.6 （3 分）

基于圖3.1，假設OD600=1 對應于細胞濃度2×108個細胞/mL。 細菌細胞的數量增加2×108個細胞／mL， 乳酸的濃度將增加1g/L。 如果培養11 h后的乳酸濃度為6 g/L，計算細菌細胞的數量（細胞／mL），并記錄在答題卡中。