乳酸發酵第2 階段能量釋放生物學教學研究

王 希 洪 鯤，2 趙玉丹 楊瑩艷 龔記熠，2 乙 引，2*

（1 貴州師范大學生命科學學院 貴州貴陽 550001 2 貴州省植物生理與發育調控重點實驗室 貴州貴陽 550001）

0 前言

普通高中課程標準實驗教材， 人教版高中生物學必修1《分子與細胞》中關于乳酸發酵的概念敘述： 無論是分解成酒精和二氧化碳或者是轉化成乳酸， 乳酸發酵都只有在第1 階段釋放出少量的能量，生成少量ATP［1］。 而能量的形式多樣，可以是勢能、熱能、化學能、電能等，這里的“能量”是否特指生物體可直接利用的能量則表述不清晰。這就可能會使學生在理解該概念時進入誤區：乳酸發酵第2 階段沒有除可供生物體生命活動需要的能量之外其他能量的釋放。 從已發表的文獻研究表明， 乳酸發酵第2 階段的確沒有ATP 產生，但丙酮酸到乳酸的轉化過程要能自發進行，需滿足ΔGθ＜0，釋放能量。

1 乳酸脫氫酶催化下H 的轉移

乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）主要存在于動物的肌肉中，L-乳酸脫氫酶使用煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）作輔酶（氧化型和還原型分別為NAD+、NADH），可逆催化氧化還原反應，使L-乳酸和丙酮酸相互轉化［2］。 李璟等［3］研究中發現乳酸脫氫酶催化的反應為可逆反應，丙酮酸和乳酸既是底物又是產物。 在骨骼肌運動等缺氧環境中，催化反應向釋放乳酸的方向進行。Anderson 等［4］證實丙酮酸被NADH 還原為乳酸的反應過程， 是氫原子H 以氫負離子（H--hydride anion）以含有2 個電子的狀態可逆地轉移到丙酮酸的2-C 位上。 侯若冰等［2］采用量子化學ab initio 計算方法分析頻率，表明反應只含一個頻率。 這與王鏡巖等［5］編著的《生物化學教程》 “在340 nm 波長處還原性NADH 有一個吸收峰，而氧化型NAD+則無”的相關表述一致。 侯若冰等［2］通過對反應物復合物、過渡態及產物復合物的能量進行精確計算，驗證結果表明反應的過渡態是H-的轉移， 即NAD 的氧化型NAD+是H-的電子接納體，NADH 是還原途徑的電子供體。該反應過程如下：NADH?NAD++H-；NADH→2e→NAD+（-0.315 V）。

生物體的代謝中，高能物質NADH 被氧化，提供2 個電子進入電子傳遞鏈，同時釋放H+，而H+在線粒體基質中可自由移動［6］。

2 H 在復合體Ⅰ中穿梭

復合體Ⅰ（complex Ⅰ）或稱NADH-Q 還原酶（NADH-Q reductase）， 含 一 個FMN 輔 基 黃 素 蛋白，L 形；一個臂位于線粒體內膜上，另一個壁伸向線粒體基質。 有氧呼吸和乳酸發酵第1 階段都在細胞質基質中發生糖酵解反應，1 分子葡萄糖釋放2 分子丙酮酸、2 分子NADH。 糖酵解中釋放的NADH 不能透過線粒體膜進入線粒體，而細胞中NAD+含量有限， 有氧條件下，NADH 釋放的電子最終被電子傳遞鏈下游復合體Ⅳ中的分子氧所接收即氧化磷酸化過程［6］。 電子經過電子傳遞鏈時，途中經過多個蛋白質復合體。復合體Ⅰ只為電子傳遞鏈中的第1 個復合體， 只有經過復合體Ⅳ時電子才能傳遞到O2，勢能足以轉化為ATP。 無氧狀態下， 糖酵解釋放大量的NADH 發生堆積，則NAD+被大量消耗，細胞質基質中NADH／NAD+值遠大于線粒體基質中NADH／NAD+值， 此時NADH可通過甘油-3-磷酸穿梭途徑和蘋果酸-天冬氨酸穿梭等途徑進入線粒體內膜，NADH／NAD+回到正常水平，以維持機體NADH／NAD+平衡［5］。

因此，無氧條件下電子傳遞鏈中斷，電子不能傳遞到O2，不能產生ATP。

3 無氧條件下的丙酮酸-乳酸發酵

人的骨骼肌在劇烈運動時處于無氧狀態下不能進行有氧呼吸， 細胞利用糖酵解釋放少量ATP暫時緩解能量不足。 糖酵解釋放的NADH 急需被氧化成NAD+，才能使糖酵解途徑中的甘油醛-3-磷酸繼續被氧化。丙酮酸被乳酸脫氫酶催化，成為NADH 的氫受體，生成乳酸。 反應如下：

4 標準還原勢計算乳酸發酵過程自由能變化

根據能斯特（Walther Nernst）方程，任何濃度下還原勢和標準還原勢的關系如（a）所示：

R為氣體常數R=8.315 J／（mol·K），T 為熱力學溫度，n 為每分子物質轉移的電子數，F 為法拉第常數F=96480 J／（V·mol），Eθ為標準還原勢。 在25℃的情況下T=298 K，人體或哺乳動物體內釋放的生物化學反應都是在pH=7 環境下,標準還原勢用E′θ表示，代入（b）中即可計算出E（25℃、pH=7）。 生物體 內 一 些E′θ可 查 詢：丙 酮 酸+2H++2e-→乳 酸 的E1′θ=-0.185 V， 丙 酮 酸/乳 酸 的E1′θ=0.185 V；NAD++H++2e-→NADH 的E2′θ=-0.320 V［5］。

根據熱力學第二定律標準自由能變化（standard free energy change）ΔGθ=-nFΔE′θ。 當ΔGθ＜0，反應自發進行且釋放能量；ΔGθ＞0 時， 反應不能自發進行。 通過計算乳酸脫氫酶催化丙酮酸生成乳酸時ΔGθ的大小， 即可判斷反應中的能量變化。 由NAD+／NADH 的氧化還原電對的E′θ=-0.320 V，丙酮酸／乳酸的氧化還原電對的E′θ=0.185 V，推導出ΔE′θ=-0.135 V，則ΔGθ=-2×［96.5 kJ／（V·mol）］×（0.135 V）=-26.055 kJ／mol，ΔGθ＜0；而在無氧條件下發生糖酵解釋放的NADH／NAD+值遠遠大于標準狀態,實際情況下ΔGθ值更小。 因此，該反應可以自發進行,反應過程釋放一定能量（ΔGθ=-26.055 kJ／mol),在賈金堂等［7］的研究文獻和周海夢等［8］譯《生物化學原理》中也得到證實，但是該放能反應無法驅動ATP 的合成。

5 乳酸發酵第2 階段ATP 的釋放研究進展

通過文獻綜述， 發現明確指出乳酸發酵第2階段能釋放能量的較少， 很多研究者較為關注乳酸發酵機理。 例如胡曉輝等［9］研究表明氧氣不足時植物有氧呼吸受到抑制同時啟動乳酸發酵，以緩解糖酵解中NAD+的不足。 劉明厚等［10］持相同觀點：馬鈴薯塊莖、甜菜塊根、胡蘿卜葉和玉米胚在進行乳酸發酵時,釋放乳酸。 賈金堂等［7］通過研究氧化還原反應中自由能變化提出乳酸發酵第2階釋放能量。 劉學廷等［11］通過比較有氧呼吸和乳酸發酵的異同點，得出乳酸發酵第2 階段丙酮酸在酶的催化下釋放乳酸，釋放少量能量。 胡四新［12］通過分析無氧狀態下糖酵解釋放的2 個NADH 全部參與乳酸發酵第2 階段反應， 提出該過程沒有ATP 的釋放。 靳國禎等［13］則持相反觀點，乳酸發酵第2 階段不但沒有ATP 的釋放，同樣沒有能量的釋放。對此，筆者比較認同乳酸發酵第2 階段沒有ATP 的產生，但NADH 攜帶的化學能一部分儲存到乳酸分子中，另一部分以熱能等形式釋放。此外，張春暉等［14］在研究蘋果酸-乳酸發酵（MLF）時發現第2 階段的確沒有底物水平磷酸化發生，但其后續研究表明, 一些厭氧細菌在無氧狀態下可以通過其他途徑獲得ATP， 該類細菌生長發育所需的能量主要源于L-蘋果酸攝入和（或）L-乳酸跨膜流出釋放質子電動勢（pmf），pmf 驅動F0F1-ATPase 合成ATP。 這表明，雖然MLF 中沒有直接產生ATP，但通過相關物質轉運間接產生ATP。

綜 上 所 述， 乳 酸 發 酵 第 2 階 段 ΔGθ=-26.055 kJ／mol，ΔGθ＜0，釋放一定能量；但不能合成ATP， 反應所釋放的能量最終以熱能等形式散失，還是用于其他途徑，沒有在文獻中找到相關論證，期待有后繼研究。