PA1864基因敲除對銅綠假單胞菌毒力及致病性的影響

張 鴻，胥志敏，陳 煒，何曉梅，熊浚智，盛哈蕾，邱 靜，張克斌

(陸軍軍醫大學第二附屬醫院 1. 醫院感染控制科； 2. 中心實驗室，重慶 400037)

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)是一種廣泛存在于自然環境的革蘭陰性條件致病菌[1]，也是醫院感染最常見的病原體之一[2-3]。PA強大的環境適應能力及復雜的毒力調控機制是導致其感染后高耐藥、高死亡的重要原因。PA的毒力組分眾多，包括菌體組分相關的菌毛、鞭毛及脂多糖[4]，胞外的分泌性毒力因子/蛋白，如綠膿素、綠色熒光素、蛋白酶、氰化物等[5-6]。此外，PA的Ⅲ型毒力蛋白分泌系統(type Ⅲ secretion system，T3SS)，其可將毒性效應蛋白ExoS、ExoT、ExoY和/或ExoU注入宿主細胞，促進宿主細胞的凋亡及炎癥反應，并在PA的急性感染中發揮重要作用[7]。PA的群體感應(quorum sensing，QS)系統根據其化學信號分子組成的不同，可分為3類，即las、rhl系統和喹諾酮(Pseudomonasquinolone signal，PQS)系統，其信號分子分別為N-3-氧代十二烷基-L-高絲氨酸內酯(N-(3-oxododecanoyl)-L-homoserine lactone，3-oxo-C12-HSL)、N-丁酰基-L-高絲氨酸內酯(N-butyryl-L-homoserine lactone，C4-HSL)和2-庚基-3-羥基-4-喹諾酮(2-heptyl-3-hydroxy-4-quinolone，PQS)[8]。

PA具有目前已知的最大的細菌基因組，其中大量基因功能仍不清楚[9]。根據PseudomonasGenome Database數據庫(http://www.pseudomonas.com)提供的生物信息學預測，PA1864蛋白可能具有DNA結合能力，并可能作為一種轉錄調節因子調節基因表達。然而，PA1864基因及其基因編碼蛋白的實際生物學功能與PA毒力及致病性間是否有關聯，目前仍無相關報道。本研究擬通過對比銅綠假單胞菌PAO1野生菌株及其PA1864基因敲除菌株(△PA1864)在細菌毒力表型及致病性中的差異，探討PA1864基因在PA毒力及致病性中的作用，為進一步揭示PA1864基因的實際生物學功能提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株與引物 PAO1/pUCP-Red、△PA1864、E.coliJM109/pSB1075、E.coliJM109/pSB536菌株均為本實驗室前期構建及保存。試驗所用的熒光定量引物見表1。

表1 熒光定量引物

1.1.2 試驗細胞與動物 人非小細胞肺癌A549細胞購于中科院上海細胞庫。試驗動物BALB/c小鼠，6～8周，雄性，體重20～25 g，購于陸軍軍醫大學實驗動物中心。動物試驗經過陸軍軍醫大學實驗動物福利倫理審查委員會審批，符合動物倫理和動物福利要求。

1.1.3 主要試劑和儀器 免疫組化試劑盒購于北京中杉金橋生物技術有限公司，CCK8細胞活性檢測試劑盒購自于上海碧云天生物技術有限公司，Annexin V-FITC凋亡試劑盒購于BD bioscience，熒光定量PCR酶、RNAiosplus、逆轉錄試劑盒購自TaKaRa，HPLC色譜柱TSKgelODS-100Z(4.6×250 mm，5 μm)購于日本東曹。電轉儀、凝膠成像系統購于Bio-Rad公司，Nanodrop微量核酸儀購于美國Thermo fisher，實時熒光定量PCR儀購于美國ABI公司，流式細胞檢測儀購于美國Beckman，高效液相色譜儀購自于美國Waters公司。

1.2 方法

1.2.1 生長曲線測定 挑取PAO1、△PA1864單菌落于20 mL LB液體培養基中37℃，200 r/min培養至對數生長期。取活化后菌液用無菌PBS緩沖液調整細菌濃度至OD600/mL=1.0。以OD600/mL=0.005的初始濃度，將PAO1接種于200 mL LB液體培養基中，37℃，200 r/min培養36 h。培養期間，每2 h取樣測定吸光度值OD600。

1.2.2 宿主致病性研究

1.2.2.1 小鼠急性肺感染模型建立 取30只6～8周BALB/c小鼠，按隨機數字表法分為PBS對照組、PAO1和△PA1864感染組，每組10只小鼠。小鼠經乙醚麻醉后，取20 μL經PBS調整后的菌液(濃度為3×109/mL)進行小鼠滴鼻感染，10 μL/鼻孔。對照組使用無菌PBS緩沖液進行相同處理。各組小鼠分籠飼養，每日記錄小鼠的健康狀況，統計小鼠的死亡數。感染后7日為觀察終點，若7日內死亡，則以死亡時間作為觀察終點。

1.2.2.2 小鼠體重檢測 感染前稱量小鼠體重并標記為W0,觀察終點時體重記為Wlast。小鼠體重變化= Wlast/W0×100%。

1.2.2.3 小鼠肺水腫檢測 取小鼠肺組織，測定濕重(wet weight，WW)，將肺組織置于70℃烤箱內烘干后測定肺組織干重(dry weight，DW)。肺水腫表示為肺組織濕重與干重之比，即WW/DW。

1.2.2.4 小鼠肺組織病變及炎癥的檢測 (1)HE染色：采用4%多聚甲醛固定液固定小鼠肺部組織，經脫水、石蠟包埋、切片后，采用蘇木素染細胞核5 min，1%鹽酸乙醇分化30 s后溫水返藍。采用伊紅復染30 s后，乙醇梯度脫水，二甲苯透明后使用中性樹膠封片。(2)免疫組化：取小鼠肺組織石蠟經脫蠟、水化、抗原修復后，3% H2O2封閉內源性過氧化物酶體。采用抗白細胞表面抗原CD45抗體和抗巨噬細胞F4/80抗體作為一抗(均購自Abcam)，以1∶200比例，4℃孵化過夜。漂洗后二抗室溫孵育，以DAB顯色，蘇木精染液復染后，1%鹽酸乙醇分化、溫水返藍、脫水、透明后封片。

1.2.3 細胞毒性檢測

1.2.3.1 細胞活力 采用含10%FBS的DMEM培養基培養A549細胞，待其生長至80%匯合度，取細胞經0.25%胰酶消化后制備單細胞懸液。按照1×104個細胞/100 μL每孔將細胞加入至96孔板中，37℃，5% CO2培養至80%匯合度。菌體感染試驗：按照感染復數MOI=50的比例加入細菌；上清液感染試驗：每孔加入100 μL過濾后的細菌培養上清液處理細胞；對照組加入等體積的含10%FBS的DMEM培養基，每組設置6個平行孔。37℃，5% CO2培養2 h，每孔加入10 μL CCK-8溶液培養2 h，酶標儀檢測A450吸光度值，計算抑制率=(1-A處理/A對照)×100%。

1.2.3.2 細胞凋亡 A549細胞按照1×106個細胞/孔鋪于6孔板，37℃，5% CO2培養至80%匯合度。按照感染復數MOI=50的比例加入細菌，37℃，5% CO2培養2 h。采用0.25%胰酶消化細胞獲取單細胞懸液。采用1×binding buffer調整細胞濃度至1×106個/mL，加入5 μL Annexin V-FITC染液，室溫避光孵育15 min后加入5 μL PI染液染色5 min，應用流式細胞術檢測菌株對細胞凋亡的影響。

1.2.4 毒力因子檢測

1.2.4.1 細菌胞外蛋白酶活性 (1)細菌培養：挑取PAO1、△PA1864單菌落于10 mL LB培養基中，37℃，200 r/min振蕩培養至對數生長期。將細菌接種于200 mL LB培養基中，至初始濃度OD600/mL=0.01。37℃，200 r/min振蕩培養24 h并于第3、6、9、12和24 h收集細菌上清-80℃保存備用。(2)牛奶平板制備：稱取疊氮鈉0.03 g、SDS 0.02 g、瓊脂粉1.0 g，溶解于0.05 mol/L Tris-HCl(pH 7.5)中，121℃高壓蒸汽滅菌30 min，加入2.0 g脫脂奶粉，充分混勻后傾倒平板，并打孔。(3)蛋白酶活性檢測：取上述細菌培養上清，按照100 μL/孔加入至牛奶平板相應孔中，37℃放置12 h，觀察透明環形成情況。

1.2.4.2 綠膿素 取上述細菌上清4 mL加入等體積氯仿，充分振蕩混勻,靜置2 h后，取下層有機相2 mL加入800 μL 2 mol/L HCl溶液。充分振蕩后靜置待其分層。取上層粉紅色鹽酸相測定A520吸光度值。

1.2.4.3 綠色熒光素 (1)金氏B培養基制備：稱取K2HPO41.5 g、MgSO41.5 g、蛋白胨20.0 g、瓊脂粉15.0 g，溶解于ddH2O并定容至1 000 mL，調整pH至7.2±0.2。(2)樣品制備：將活化細菌接種于20 mL金氏B培養基中，至初始濃度OD600/mL=0.01，37℃，200 r/min振蕩培養12 h，取4 mL菌液，12 000 r/min常溫離心5 min，分別收集細菌菌體和上清。菌體沉淀用于細菌濃度(A600)測定，上清用于綠色熒光素檢測。(3)綠色熒光素檢測：取上述細菌上清加入0.1 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)稀釋3倍。取稀釋液后菌液測定其A405吸光度值。按照A450/A600矯正細菌綠色熒光素含量。

1.2.4.4 細菌泳動能力 (1)泳動平板制備：稱取胰蛋白胨 10.0 g、NaCl 5.0 g、Difco瓊脂粉5.0 g，加入ddH2O中溶解并定容至1 000 mL。121℃高壓蒸汽滅菌30 min，傾倒平板。(2)泳動能力檢測：取1.2.4.1步驟中收集的12 h菌液上清1 μL點于平板中央，30℃靜置培養12 h，觀察細菌運動情況。

1.2.5 T3SS系統 (1)RT-qPCR檢測基因表達：取1.2.4.1步驟獲取的菌體沉淀，加入1.0 mL RNAios plus裂解菌體，提取細菌RNA。RT-qPCR檢測exoS、pcrV基因表達水平，并設置rplU為內參基因。(2)Western blot檢測蛋白表達水平：取1.2.4.1步驟獲取的細菌沉淀加1 mL mol/L RIPA裂解液(PMSF終濃度1 mmol/L)，冰上超聲破碎(振幅30%，超5 s，停10 s，超聲5 min)，4℃，12 000 r/min離心10 min收集菌體蛋白。采用抗ExoS和PcrV多克隆抗體Western blot檢測蛋白表達水平。

1.2.6 QS系統 (1)信號分子提取：取1.2.4.1步驟獲取的菌液上清8 mL與等體積乙酸乙酯(0.5%甲酸酸化)混合，渦旋振蕩，靜置分層后取有機相，蒸發干燥后，50%甲醇溶解，-20℃保存。(2)報告菌株平板法檢測3-oxo-C12-HSL或C4-HSL含量：分別接種信號分子報告菌株E.coliJM109/pSB1075(檢測3-oxo-C12-HSL)和E.coliJM109/pSB536(檢測C4-HSL)于LB液體培養基中，30 ℃，200 r/min振蕩培養至對數生長期。取70 mL培養菌液，加入至140 mL含2.1%瓊脂的LB 培養基中(終濃度0.7%)。傾倒平板，凝固后打孔，每孔加入50 μL信號分子樣品。30℃避光培養12 h，凝膠成像儀曝光，檢測報告菌株的生物發光環。(3)高效液相色譜法(HPLC)檢測PQS含量：采用等度洗脫法進行檢測。流動相：86%甲醇(1%冰醋酸酸化)和14%超純水(1% 冰醋酸酸化)，流速1 mL/min，Waters 2998 Photodiode Array檢測器檢測樣品A325吸光值。PQS標準品進樣濃度250 μg/mL。通過比較標準品和樣品峰面積，計算樣品中PQS含量。

1.3 統計學分析 應用GraphPad Prism 5.0軟件作圖，應用SPSS 20.0軟件進行統計分析，組間比較采用單因素方差分析或t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PA生長情況 檢測PAO1及△PA1864菌株在LB液相培養條件下的菌體濃度，PA細菌生長曲線結果顯示，0～6 h為生長遲緩期，6～16 h為對數期，16～28 h為穩定期，在28 h后細菌處于衰亡期。PAO1與△PA1864的生長曲線無明顯差別。見圖1。

圖1 野生菌株PAO1與基因敲除菌株△PA1864生長曲線

Figure1Growth curves of PAO1 wild type strain and gene knockout strain △PA1864

2.2 PA1864基因敲除對PA宿主致病性的影響 與PAO1感染組相比，△PA1864菌株感染組小鼠死亡率降低，體重降低減緩，肺水腫情況明顯改善。HE染色結果顯示，△PA1864感染小鼠肺組織炎癥細胞浸潤、組織損傷及肺泡腔內出血嚴重程度低于PAO1感染組。免疫組化檢測白細胞表面抗原CD45及巨噬細胞表面抗原F4/80，△PA1864感染小鼠肺組織浸潤的白細胞及巨噬細胞低于PAO1感染組。見圖2。

2.3 PA1864基因敲除對PA細胞毒性的影響 采用PAO1、△PA1864細菌及其分泌上清分別感染A549細胞，并通過CCK-8法檢測細胞活性，結果顯示，與PAO1感染組相比，△PA1864菌體感染組的細胞抑制率明顯降低，差異具有統計學意義；△PA1864分泌上清感染細胞組細胞活性略有下降，但不具有統計學意義。△PA1864菌體感染的A549細胞凋亡(早期凋亡+晚期凋亡)情況較PAO1感染組更輕。△PA1864菌體感染A549細胞的細胞凋亡率低于PAO1組，且差別具有統計學意義。見圖3。

2.4 PA1864基因敲除對PA運動及分泌性毒力因子的影響 綠膿素含量檢測結果顯示，隨著培養時間的延長，細菌產生的綠膿素逐漸增加，且在培養24 h后△PA1864菌株產生的綠膿素含量高于PAO1菌株。△PA1864菌株在對數生長期產生的綠色熒光素略低于PAO1菌株，但差異無統計學意義。

A：小鼠生存曲線；B：小鼠體重變化；C：小鼠肺組織水腫檢測；D：小鼠肺組織HE染色；E：小鼠肺組織免疫組化染色(CD45、F4/80)； **：P<0.01；*：P<0.05

圖2PA1864基因敲除對PA宿主致病性的影響

Figure2Effect of PA1864 gene knockout on pathogenicity of PA to host

△PA1864與PAO1菌株分泌性蛋白酶(主要是彈性蛋白酶)的產生未見明顯差別。觀察細菌運動方式，試驗結果顯示，與PAO1菌株相比，△PA1864菌株的泳動環直徑明顯減小，泳動環直徑檢測證實該差異具有統計學意義。見圖4。

2.5 PA1864基因敲除對PA T3SS的影響 與PAO1野生株相比，△PA1864的exoS、pcrV和exsA基因表達水平在細菌培養的早期(3 h和6 h)明顯下調，而在細菌對數生長中晚期(12 h)未有明顯變化。Western blot也證實，在細菌生長的早期(3 h和6 h)，△PA1864菌株的ExoS和PcrV蛋白表達量低于PAO1野生菌株。見圖5。

A：CCK-8法檢測菌體感染對細胞的毒性；B：CCK-8法檢測細菌培養上清液對細胞的毒性；C：細胞凋亡比例統計；D：流式細胞術檢測細菌感染后細胞凋亡情況(C--象限為活細胞,C+-象限為早期凋亡細胞, C++象限為晚期凋亡細胞, C-+象限為壞死細胞)；**：P<0.01；*：P<0.05；n.s：與PAO1感染組相比，差異無統計學意義

圖3PA1864基因敲除對PA細胞毒性的影響

Figure3Effect of PA1864 gene knockout on cytotoxicity of PA

A：綠膿素含量檢測；B：綠色熒光素含量檢測；C：牛奶平板法檢測蛋白酶活性；D：運動平板法檢測細菌泳動能力; E：泳動環直徑測定；**：P<0.01；*：P<0.05；n.s：與PAO1組相比差異無統計學意義

圖4PA1864基因敲除對PA毒力相關表型的影響

Figure4Effect of PA1864 gene knockout on PA virulence-related phenotypes

A：RT-qPCR檢測T3SS相關蛋白編碼基因exoS、pcrV和exsA的表達水平；B：Western blot檢測ExoS和PcrV蛋白表達情況；*：P<0.05；n.s：與PAO1組相比差異無統計學意義

圖5PA1864基因敲除對T3SS相關基因及蛋白表達的影響

Figure5Effect of PA1864 gene knockout on T3SS-related genes and protein expression

2.6 PA1864基因敲除對PA QS系統信號分子合成的影響 檢測las、rhl系統信號分子，結果顯示，3-oxo-C12-HSL含量在細菌培養至6 h時即可明顯檢測到，而C4-HSL含量在細菌對數生長的中晚期(12 h)明顯升高；與野生株PAO1相比，△PA1864菌株培養上清中3-oxo-C12-HSL和C4-HSL合成量無明顯區別。見圖6。HPLC法檢測細菌培養上清中PQS信號分子的合成量，結果顯示，在細菌培養至12 h即可明顯檢測到PQS產生，且隨著培養時間延長至24 h，其產量逐漸增加。與PAO1相比，△PA1864菌株的PQS信號分子合成量明顯高于PAO1菌株。見圖7。

3 討論

PA1864基因是PA的一個未知功能基因，位于PA基因組負義鏈上(2023281～2023931)，編碼基因長度為648 bp，基因編碼蛋白由216個氨基酸組成，分子量為23.9 KDa。本研究使用的△PA1864菌株為課題組前期構建保存。構建方法是采用融合PCR方法獲得含有四環素抗性基因的打靶片段，基因測序證實融合成功后，利用Red同源重組系統使基因打靶片段與目的基因發生同源重組，從而實現PA1864基因的原位敲除[10]。菌株構建后通過交叉PCR方法鑒定證實△PA1864菌株構建成功。

圖6 報告菌株平板法檢測AHL信號分子合成情況

Figure6Synthesis of AHL signal molecule detected by strain plate method

A：HPLC檢測PQS信號分子峰圖；B：HPLC檢測后PQS信號分子含量計算結果；**：P<0.01；n.s：與PAO1組相比差異無統計學意義

圖7HPLC法檢測PQS信號分子合成情況

Figure7Synthesis of PQS signal molecule detected by high performance liquid chromatography

研究比較野生菌株PAO1與敲除菌株△PA1864對急性肺感染小鼠致病性的差異，發現與PAO1感染組相比，△PA1864感染組的小鼠死亡率下降，肺部水腫和炎癥細胞浸潤降低，提示PA1864基因敲除可抑制PA急性感染。PA1864基因敲除后PA的細胞抑制率明顯下降，并且可抑制細菌感染誘導的細胞凋亡，提示PA1864基因敲除會導致PA細胞毒性下降，說明PA1864基因敲除在體內和體外環境中均可導致PA致病性下降。

細菌的致病性與其毒力密切相關。為進一步評價PA1864基因敲除對PA毒力因子/蛋白的分泌及泳動能力的影響，對PA分泌性毒力因子/蛋白和細菌泳動能力進行檢測。PA毒力相關表型檢測發現，PA1864基因敲除對PA綠色熒光素和分泌性彈性蛋白酶的合成及分泌無明顯影響，但是可以抑制PA T3SS蛋白(如ExoS和PcrV)表達及泳動能力，可以促進PA綠膿素的分泌。盡管PA綠膿素分泌水平在PA1864基因敲除后有所上升，但由于綠膿素主要在細菌培養的中晚期產生，且其主要與PA的長期慢性感染相關。因此，推測PA1864基因敲除引起的綠膿素產量增加在PA的急性期感染中并不起主要作用。T3SS是加劇PA急性期感染最關鍵的毒力系統，PA1864基因敲除后引起的T3SS下降很可能是導致△PA1864菌株急性期感染致病性及細胞毒性降低的關鍵。

QS系統是細菌密度依賴性的基因調控系統，其可通過細菌分泌的化學信號分子彼此感知、交流、相互協調，與細菌的毒力及環境適應性密切相關。當3-oxo-C12-HSLs、C4-HSLs和PQS信號分子與其相應的轉錄調節因子LasR、RhlR和PqsR結合后可形成復合物，該復合物可通過調節PA毒力因子/蛋白合成相關基因，從而調節PA的毒力[11]。據報道，PA多種毒力表型與QS系統調節有關，如彈性蛋白酶的分泌主要受las系統正向調節[12]，綠膿素的合成受rhl、pqs系統正向調節[13-14]，T3SS可受pqs系統和rhl系統負向調節[15]。為探討PA1864基因敲除對PA QS系統的影響，采用信號分子報告平板法分別檢測PAO1和△PA1864細菌培養上清中3-oxo-C12-HSL(las系統)和C4-HSL(rhl系統)信號分子的含量，結果表明，PA1864基因敲除對PA las及rhl系統無明顯影響；采用HPLC檢測pqs系統PQS信號分子合成情況，發現PA1864基因敲除可引起PA的pqs系統信號分子合成明顯上調，與文獻[11-14]報道一致。本組試驗結果發現，PA1864基因敲除可引起pqs系統上調的同時，伴隨T3SS的抑制和綠膿素合成的增加。因此，我們推測PA1864基因很可能是通過pqs系統影響PA毒力相關表型，從而最終影響PA的致病性，但其相關假設仍需進一步驗證。

PA是醫院感染的重要病原體，在一般情況下不致病，但當患者機體免疫力低下、長期應用糖皮質激素/免疫抑制劑、腫瘤放射治療、化學治療、手術創傷以及侵入性診療后[2]，往往可造成致命性打擊。PA在環境中具有極強的適應性，且難以清除，與其具有龐大和復雜的調節調控網絡密切相關。PA毒力除受QS系統調節外，還受雙組分調節系統(two-component regulatory systems，TCSs)、環二鳥苷酸(cyclic diguanylate，c-di-GMP)等多種因素及途徑調節。本研究針對未知基因PA1864在PA急性感染中的毒力及致病性進行初步研究，并發現PA1864基因可能作為一種轉錄調節因子參與基因表達調節，但PA1864基因介導的具體調節機制以及與其他調節因素和途徑的關聯尚未深入，仍有待后續研究。