寨卡病毒包膜蛋白重組人腺病毒5型載體的構(gòu)建與免疫原性測(cè)定

馬曉瑞，羅升學(xué)，王一琳，張攀麗，劉博超，趙 衛(wèi)，李婷婷，黎誠(chéng)耀

(南方醫(yī)科大學(xué) 1. 檢驗(yàn)與生物技術(shù)學(xué)院輸血醫(yī)學(xué)系； 2. 公共衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學(xué)學(xué)院三級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510515)

寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)于1947年在烏干達(dá)寨卡叢林的恒河猴中發(fā)現(xiàn)，2007年在西太平洋密克羅尼西亞聯(lián)邦的雅浦島首次暴發(fā)流行，一直未得到廣泛的關(guān)注。隨著2015年巴西暴發(fā)大規(guī)模的嬰兒小頭畸形病例，ZIKV感染的潛在危害才引起全球重視。ZIKV對(duì)普通人群威脅不大，感染者可出現(xiàn)輕微發(fā)熱或皮疹，部分感染者可能還會(huì)出現(xiàn)結(jié)膜炎、肌肉和關(guān)節(jié)痛以及疲勞感。孕婦感染后會(huì)干擾胎兒神經(jīng)發(fā)育系統(tǒng)，可能導(dǎo)致胎兒流產(chǎn)、新生兒小頭畸形，甚至死亡。同時(shí)，ZIKV還是格林-巴利綜合征(guillainbarre syndrome，GBS)的一個(gè)觸發(fā)因素[1-2]。ZIKV通過(guò)受感染的伊蚊屬蚊蟲叮咬傳播，主要涉及熱帶地區(qū)的埃及伊蚊、白紋伊蚊等，此外還可通過(guò)性傳播、母嬰傳播等。蚊子生存和繁殖環(huán)境擴(kuò)大，同時(shí)受城市化與全球化影響，使ZIKV具有成為主要都市流行病的風(fēng)險(xiǎn)。研究[3-4]報(bào)道，ZIKV和登革病毒均主要由伊蚊傳播，因此其可能沿登革病毒地理分布進(jìn)行擴(kuò)散。我國(guó)過(guò)去25年每年均有登革熱病例報(bào)道，ZIKV也可能在我國(guó)流行，一旦流行將嚴(yán)重危害人口健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展。ZIKV感染傳播迅速，但是目前的預(yù)防戰(zhàn)略僅限于蚊蟲控制，加強(qiáng)獻(xiàn)血篩查血液供應(yīng)保護(hù)措施等，因此，加快安全有效的疫苗研制至關(guān)重要[5]。近期已有美國(guó)研究者構(gòu)建了表達(dá)ZIKV包膜蛋白(prM-Env)的DNA疫苗，并在小鼠模型檢測(cè)到其具有很強(qiáng)的特異性體液免疫保護(hù)作用[6]。在預(yù)防性疫苗研究方面，已有病毒滅活疫苗、減毒活疫苗、DNA疫苗、病毒載體疫苗處于臨床前或臨床試驗(yàn)早期[7-9]，但目前尚無(wú)疫苗投放市場(chǎng)[10]。重組腺病毒(recombinant adenovirus，rAd)作為目前最高效、可靠的重組病毒表達(dá)系統(tǒng)之一，已被廣泛用于基因治療和疫苗載體的各個(gè)領(lǐng)域。本研究利用成熟的商業(yè)化腺病毒AdMaxTM包裝系統(tǒng)，將編碼ZIKV包膜蛋白prM-E基因重組到E1缺失的復(fù)制缺陷型5型腺病毒(rAd5)載體上，誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生針對(duì)ZIKV的特異性細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)，為ZIKV候選疫苗的研制提供可靠的免疫原。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 ZIKV毒株Z16006(GenBank：KU955589.1)病毒總RNA由南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學(xué)學(xué)院三級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室趙衛(wèi)教授提供。PrimeScript II High Fidelity RT-PCR Kit(Code No.R023A)(TaKaRa Biotechnology Ltd)，引物由北京六合華大基因科技有限公司合成，DNA測(cè)序由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司完成。pDC315和pBHGlox(delta)E1,3Cre(哈爾濱獸醫(yī)研究所馬傳染病與慢病毒病創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)惠贈(zèng))，Mouse IFN-γ ELISpot plus kit(Mabtech)，Concanavalin A(Sigma，上海)，ZIKV Env protein(Fitzgerald，cat.no.30-1932)，寨卡E-56抗體(貝若凡生物科技有限公司，BF-1176-56)，PE-Cy7小鼠熒光二抗(BD pharmingen)，辣根過(guò)氧化酶HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(北京博爾西生物科技有限公司)。

1.2 prM-E基因片段的分離與穿梭質(zhì)粒載體的構(gòu)建 根據(jù)文獻(xiàn)[11]報(bào)道的日本乙型腦炎病毒(JEV)信號(hào)肽氨基酸序列進(jìn)行核苷酸編碼，確定其堿基序列為5’-ATGGGCAAGAGGTCCGCTGGATCCATTATGTGGTTAGCATCCTTAGCTG-TCGTGATTGCATGTGCAGGCGCA-3’。設(shè)計(jì)兩對(duì)引物F1、R1 和F2、R2，其中F2序列過(guò)長(zhǎng)分為F2-1和F2-2進(jìn)行合成(表1)。RT-PCR獲得prM-E片段連接克隆載體pLB/prM-E與穿梭質(zhì)粒pDC315，同時(shí)用EcoRI和BamHI雙酶切，酶切得到片段prM-E和載體pDC315連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α，獲得重組穿梭質(zhì)粒pDC315/prM-E，并測(cè)序鑒定，以間接免疫熒光法和Western blot方法檢測(cè)表達(dá)情況。

表1 prM-E擴(kuò)增引物

1.3 重組腺病毒的包裝、擴(kuò)增及純化 6孔板內(nèi)293A細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)，在190 μLOpti-MEM中加入1 μg穿梭載體pDC315-prM-E和1 μg腺病毒骨架質(zhì)粒Ad5 bone以及6 μL X-Treme，細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行質(zhì)粒同源重組。包裝好的重組腺病毒rAd5/prM-E進(jìn)行蝕斑篩選獲得單一穩(wěn)定的病毒株。空斑純化后的病毒株感染293A細(xì)胞進(jìn)行大量擴(kuò)增，擴(kuò)增所得病毒液用1.4 g/mL和1.2 g/mL的氯化銫以密度梯度離心法進(jìn)行濃縮。

1.4 蛋白表達(dá)鑒定 分別以pDC315空載體質(zhì)粒和重組穿梭質(zhì)粒pDC315-prM-E轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，72 h后采用間接免疫熒光法檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物中的ZIKV E蛋白：以寨卡E-56抗體孵育細(xì)胞，PE-Cy7小鼠熒光二抗染色后，熒光顯微鏡下觀察是否有目的E蛋白表達(dá)。分別以包裝、純化及濃縮后重組病毒rAd5/prM-E感染293A細(xì)胞，72 h后收感染細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物(同時(shí)收集未感染的293A細(xì)胞裂解產(chǎn)物作為陰性對(duì)照)，采用Western blot方法檢測(cè)產(chǎn)物中是否有目的E蛋白表達(dá)：以寨卡E-56抗體反應(yīng)(GAPDH作為內(nèi)參)，HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG孵育后，加底物顯色，觀察結(jié)果。

1.5 小鼠免疫接種 5周齡，體重18～20 g的健康雌性C57BL/6小鼠20只，根據(jù)接種試劑不同分為3個(gè)組，其中實(shí)驗(yàn)組分為3個(gè)接種滴度，每個(gè)滴度5只小鼠，安慰劑組2只小鼠，陰性對(duì)照組3只小鼠。每只小鼠后肢大腿根部肌內(nèi)注射100 μL溶劑，病毒接種劑量及接種方案見表2。第0周初次免疫，第3周加強(qiáng)免疫，所有小鼠在第5周處理取材，取眼球血獲得血清，取脾分離脾淋巴細(xì)胞。固相酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)(ELISpot)檢測(cè)特異性T細(xì)胞反應(yīng)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)免疫后小鼠血清抗體滴度。

表2 小鼠免疫接種方案

1.6 IFN-γELISpot實(shí)驗(yàn) 小鼠取脾分離淋巴細(xì)胞，IFN-γ ELISpot板每孔加入5×105個(gè)脾淋巴細(xì)胞，ELISpot方法檢測(cè)特異性T細(xì)胞反應(yīng)：ZIKV Env蛋白以終濃度10 μg/mL刺激細(xì)胞[分別以1640完全培養(yǎng)基和刀豆素(ConA)刺激作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照],加入刺激物后ELISpot板于37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)36 h。培養(yǎng)結(jié)束后按照Mouse IFN-γ ELISpot plus kit(Mabtech)試劑盒說(shuō)明書完成后續(xù)檢測(cè)。ELISpot反應(yīng)陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性刺激孔中有IFN-γ分泌，ZIKV Env蛋白刺激孔中每106脾淋巴細(xì)胞特異性斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)(SFCs)大于40，且大于三倍的陰性刺激孔斑點(diǎn)值。

1.7 血清ELISA實(shí)驗(yàn) 小鼠眼球取血，分離血清。ELISA實(shí)驗(yàn)所需的重組寨卡病毒包膜糖蛋白(ZIKV rE)按照本實(shí)驗(yàn)室之前建立的方法在果蠅S2細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)獲得[12]。ELISA板以7 μg/mL ZIKV rE蛋白在0.05 mol/L，pH=9.6碳酸鹽溶液中于4℃冰箱包被過(guò)夜，以間接ELISA標(biāo)準(zhǔn)操作步驟完成后續(xù)檢測(cè)。以PBS對(duì)照組的小鼠血清相應(yīng)稀釋度為基準(zhǔn)，血清抗體滴度定義為OD值大于2倍基準(zhǔn)值(S/CO>2)的最高稀釋度的倒數(shù)，最終結(jié)果以血清抗體滴度的Log10值表示。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的擴(kuò)增及鑒定 RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，可見prM-E片段特異性目的條帶，與預(yù)期2 001 bp相符(圖1A)。連接克隆載體的pLB/prM-E質(zhì)粒經(jīng)EcoRI和BamHI雙酶切,產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，在約2 974 bp處顯示載體條帶，在約2 001 bp可見特異性prM-E目的條帶，與預(yù)期相符(圖1B)，成功獲得正確的目的基因片段prM-E。

M：10 000 bp DNA Marker；A:RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳鑒定，1、2為prM-E RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；B：克隆載體pLB/prM-E雙酶切鑒定，1、2為pLB/prM-E雙酶切產(chǎn)物

圖1prM-E PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及鑒定電泳圖譜

Figure1Electrophoresis map of PCR amplification and identification of prM-E

2.2 重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 RT-PCR擴(kuò)增得到的prM-E基因前加入JEV信號(hào)肽和Kozak序列，獲得的片段插入到穿梭載體pDC315中，構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pDC315-prM-E示意圖見圖2。穿梭質(zhì)粒經(jīng)EcoRI和BamHI雙酶切后，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，可見兩條清晰的條帶，在約3 913 bp處顯示載體條帶，在約2 000 bp可見特異性prM-E目的條帶(圖3)。選取圖3中泳道2對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒樣品進(jìn)行測(cè)序鑒定，結(jié)果正確，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖2 重組穿梭質(zhì)粒pDC315-prM-E的結(jié)構(gòu)示意圖

M：10 000 bp DNA Marker；1、2 為pDC315-prM-E雙酶切產(chǎn)物

Figure3Electrophoresis map of double-digestion product of shuttle-plasmid pDC315-prM-E

2.3 蛋白表達(dá)鑒定 間接免疫熒光法檢測(cè)結(jié)果于熒光顯微鏡下觀察，用綠色光源激發(fā)抗體孵育后的重組穿梭質(zhì)粒pDC315-prM-E轉(zhuǎn)染293A，可見特異性紅色熒光，而pDC315空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293A的陰性對(duì)照組未見熒光。見圖4。

A：pDC315空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞；B：pDC315/prM-E轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞

圖4ZIKV E蛋白表達(dá)免疫熒光鑒定結(jié)果

Figure4Expression of ZIKV E protein identified by immunofluorescence

Western blot方法鑒定結(jié)果可見，分別以包裝、純化及濃縮后重組病毒rAd5/prM-E感染293A細(xì)胞，表達(dá)產(chǎn)物均可見56 kDa的特異性ZIKV E蛋白目的條帶，而293A裂解產(chǎn)物陰性對(duì)照未見特異性條帶。見圖5。ZIKV E蛋白能夠在重組病毒載體中正確、穩(wěn)定表達(dá)。

A：包裝及純化后病毒表達(dá)鑒定，1為293A細(xì)胞，2為pDC315-prM-E單質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞,3為包裝出的病毒rAd5/prM-E感染293A細(xì)胞，4為空斑純化后病毒株感染293A細(xì)胞；B：濃縮后病毒表達(dá)鑒定，1為293A細(xì)胞，2和3為濃縮后病毒rAd5/prM-E感染293A細(xì)胞；M為10～140 kD蛋白Marker

圖5ZIKV E蛋白表達(dá)Western blot鑒定結(jié)果

Figure5Expression of ZIKV E protein identified by Western blot

2.4 IFN-γ ELISpot檢測(cè)特異性T細(xì)胞反應(yīng) 采用ELISpot檢測(cè)經(jīng)ZIKV Env蛋白刺激的小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌的特異性IFN-γ SFCs，將每106脾淋巴細(xì)胞中SFCs記為最終數(shù)值。不同劑量rAd5/prM-E免疫組結(jié)果分別為(688.54±186.43)、(1 084.90±144.14)和(1 640.20±147.13)SFCs/106脾淋巴細(xì)胞，與病毒劑量呈正比關(guān)系，且均高于接種109PFU的rAd5/EGFP的對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。重組病毒載體能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生強(qiáng)而有效的ZIKV特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)。見圖6。

***：P<0.001

Figure6Detection result of cellular immune response in immunized mice

2.5 ELISA檢測(cè)免疫后小鼠血清抗體滴度 不同劑量病毒免疫后小鼠的血清抗體滴度(以log10值表示)分別為(3.14±0.39)、(3.50±0.30)和(3.74±0.25)。隨著病毒劑量的增高，小鼠血清抗體滴度具有增高趨勢(shì)，且試驗(yàn)組小鼠血清抗體滴度均高于接種109PFU的rAd5/EGFP對(duì)照組的小鼠，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。重組病毒載體能夠有效誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生針對(duì)ZIKV E蛋白的特異性體液免疫。見圖7。

**：P<0.01，***：P<0.001

Figure7Detection result of humoral immune response in immunized mice

3 討論

ZIKV對(duì)孕婦、旅行者以及公眾的感染風(fēng)險(xiǎn)持續(xù)存在，其感染引發(fā)的新生兒小頭癥和先天畸形給患者及其家庭、社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)[4]。世界衛(wèi)生組織于2016年2月1日宣布ZIKV成為全球緊急公共衛(wèi)生事件。ZIKV疫苗有助于預(yù)防和控制ZIKV暴發(fā)流行。本研究成功獲得一株高表達(dá)ZIKV包膜蛋白prM-E的腺病毒載體rAd5/prM-E，能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生強(qiáng)而有效的ZIKV特異性細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)，為ZIKV候選疫苗的研制積累了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，提供了可靠的免疫原。

ZIKV是黃病毒科黃病毒屬的單股正鏈RNA病毒，分為亞洲型和非洲型兩個(gè)基因型，已有研究[13-14]表明，ZIKV的兩種基因型相似性高達(dá)95%，僅代表一種血清型，感染或者接種一個(gè)ZIKV毒株可以引發(fā)針對(duì)所有ZIKV毒株的廣泛中和抗體，因此一種疫苗抗原將對(duì)所有的ZIKV毒株產(chǎn)生保護(hù)。ZIKV包膜糖蛋白E與細(xì)胞受體相互作用介導(dǎo)病毒融合并進(jìn)入靶細(xì)胞，是中和抗體的主要靶點(diǎn)，基于ZIKV prM-E蛋白的DNA 疫苗在小鼠體內(nèi)具有很強(qiáng)的特異性免疫保護(hù)作用[6, 15]。由于prM-E蛋白的單獨(dú)表達(dá)需要在prM蛋白前加一段信號(hào)肽序列，故根據(jù)已有文獻(xiàn)報(bào)道選擇了來(lái)源于日本乙型腦炎病毒C末端的信號(hào)肽序列[16-17]，同時(shí)在目的基因前加入Kozak序列用來(lái)增強(qiáng)真核表達(dá)。

rAd作為目前最高效可靠的重組病毒表達(dá)系統(tǒng)之一，已被廣泛用于基因治療和疫苗載體的各個(gè)領(lǐng)域。其中重組人血清5型腺病毒(rAd5)是誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)外源基因的特異性T細(xì)胞和B細(xì)胞免疫反應(yīng)最強(qiáng)的腺病毒，是一個(gè)對(duì)目的蛋白在動(dòng)物模型上進(jìn)行免疫原性評(píng)價(jià)以及進(jìn)行臨床前評(píng)價(jià)階段的理想載體。本研究利用成熟的商業(yè)化腺病毒AdMaxTM系統(tǒng)構(gòu)建包裝與表達(dá)ZIKV prM-E蛋白，獲得高純度、高滴度(2.18×1012PFU/mL)的病毒載體疫苗。小鼠接種重組病毒載體疫苗后未見不良反應(yīng)，體重和進(jìn)食正常。為研究病毒載體疫苗接種劑量對(duì)免疫效果的影響，對(duì)不同免疫試驗(yàn)組進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)rAd5/prM-E免疫組小鼠抗原特異性IFN-γ分泌量與病毒接種劑量(107、108、109PFU)呈正相關(guān)，血清抗體滴度隨著病毒劑量的增加具有一定增高的趨勢(shì)，且均高于對(duì)照組小鼠。綜合以上結(jié)果，說(shuō)明重組腺病毒載體疫苗rAd5/prM-E能夠強(qiáng)烈有效地誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生針對(duì)ZIKV的特異性細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)。但是，臨床試驗(yàn)表明，人體針對(duì)rAd5本身存在的十分普遍的預(yù)存免疫，會(huì)顯著降低病毒載體在人體內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平[18-19]，針對(duì)此狀況，最直接的方法是用其他種屬外殼的人血清型腺病毒載體或直接應(yīng)用非人類血清型的腺病毒載體，解決人群中預(yù)存Ad5中和抗體的問(wèn)題[20-21]。故本課題組同時(shí)在構(gòu)建基于黑猩猩腺病毒Sad23、Sad25和人類稀有型腺病毒Ad35和Ad49的新型腺病毒疫苗載體，結(jié)合本研究成果ZIKV-prM-E蛋白抗原基因，以期成功構(gòu)建可用于臨床的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的ZIKV新型腺病毒載體疫苗。