CRKP碳青霉烯酶基因檢測(cè)及同源性分析

陳 婭，邱隆敏

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 1. 感染科； 2. 感染管理科，貴州 遵義 563003)

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae,KPN)是革蘭陰性(G-)桿菌，需氧或兼性厭氧，屬于機(jī)會(huì)性病原體，廣泛分布于醫(yī)院的各種環(huán)境中，可引起患者多種組織器官的感染，常見的有血液系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)等。β-內(nèi)酰胺類抗生素中，抗菌活性最強(qiáng)、抗菌譜最廣的是碳青霉烯類抗生素，因其只對(duì)細(xì)菌有殺傷作用，故對(duì)宿主毒性小，對(duì)頭孢菌素酶(AmpC酶)及超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases,ESBLs)作用效果穩(wěn)固，是治療大多數(shù)革蘭陽(yáng)性(G+)菌、G-菌及耐藥菌感染的極佳藥物。但近年來，耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae,CRKP)的檢出率逐步攀升，并已在全球多個(gè)國(guó)家散發(fā)和(或)流行[1-2]。CRKP的耐藥機(jī)制極其復(fù)雜，結(jié)合各個(gè)國(guó)家和地區(qū)的研究報(bào)道[3-4]，主要包括以下四個(gè)方面：(1)產(chǎn)碳青霉烯酶；(2)高產(chǎn)AmpC酶或ESBLs，且外膜孔蛋白(outer membrane porin,OMP)缺失或者OMP表達(dá)量減少；(3)青霉素結(jié)合位點(diǎn)缺失；(4)外排泵系統(tǒng)作用等，其中以產(chǎn)碳青霉烯酶最常見和重要。本研究收集2017年1—12月某大型三甲醫(yī)院分離自臨床各科室的CRKP，檢測(cè)碳青霉烯酶基因，并進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)該院2017年存在ST11型和ST875型CRKP的克隆流行，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集某三甲醫(yī)院2017年1—12月臨床各科室分離的CRKP 22株。菌株入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)為CRKP；(2)少數(shù)患者住院期間多次培養(yǎng)出CRKP，則納入該患者首次培養(yǎng)的CRKP；(3)CRKP感染患者住院資料完整。質(zhì)控菌株為大腸桿菌ATCC 25922(購(gòu)于大連寶公司)，陽(yáng)性對(duì)照菌為該院2016年發(fā)現(xiàn)的并經(jīng)測(cè)序確證的產(chǎn)KPC-2型CRKP和產(chǎn)NDM-1型CRKP。

1.2 主要儀器和試劑 VITEK 2 Compact分析系統(tǒng)(生物梅里埃公司)，高速離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)，PCR擴(kuò)增儀、PowerPac Basic電泳儀、GelDocXR凝膠成像系統(tǒng)均為美國(guó)伯樂Bio-Rad公司產(chǎn)品，厄他培南(ETP)、亞胺培南(IPM)及美羅培南(MEM)三種10 μg/片的藥敏紙片均為Oxoid公司產(chǎn)品，IPM粉劑及ETP粉劑購(gòu)自杭州默沙東公司，MEM粉劑購(gòu)自深圳市海濱公司，細(xì)菌蛋白提取試劑盒、M-H培養(yǎng)基、酚紅、EDTA、瓊脂糖Agarose、硼酸、Tris堿、GoldView I型核酸染色劑均為北京索來寶產(chǎn)品，ZnSO4·7H2O(上海拜力公司)，引物合成(上海生工)，2×Taq PCR Master Mix(北京派拓公司)，DNA Marker(2 000 bp)(寶日醫(yī)公司)等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 藥敏試驗(yàn) 試驗(yàn)結(jié)果判斷參照2018版美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)(Clinical and Laboratory Standard Institute,CLSI)[5]。

1.3.1.1 藥敏紙片擴(kuò)散法(K-B法) 采用K-B法測(cè)定菌株對(duì)IPM、MEM及ETP三種藥敏紙片的抑菌圈直徑。

1.3.1.2 微量肉湯稀釋法 通過微量肉湯稀釋法測(cè)定菌株對(duì)IPM、MEM和ETP的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)。

1.3.2 碳青霉烯酶檢測(cè)

1.3.2.1 改良Hodge試驗(yàn)(modified Hodge testing,MHT) 取適量大腸埃希菌ATCC 25922的菌落置于生理鹽水中，用比濁儀配制為0.5麥?zhǔn)蠁挝唬?∶10稀釋后分別均勻涂布于3個(gè)M-H瓊脂平板，干燥3～10 min后，3個(gè)平板中央分別貼IPM、MEM及ETP藥敏紙片，從平板邊緣向紙片邊緣依次劃線接種待測(cè)菌株、陽(yáng)性對(duì)照及陰性對(duì)照菌，直線至少長(zhǎng)20～25 mm，需氧(35±2)℃培養(yǎng)16～20 h后觀察結(jié)果。判斷標(biāo)準(zhǔn)：待測(cè)菌株若產(chǎn)生碳青霉烯酶(MHT陽(yáng)性)，則大腸埃希菌ATCC 25922的抑菌環(huán)周邊和待測(cè)菌株接種線交匯處有菌株增強(qiáng)生長(zhǎng)的情況，呈蘋果蒂現(xiàn)象。

1.3.2.2 Carba NP試驗(yàn) Carba NP A液為取2 mL 0.5%的酚紅溶液加入到16.6 mL的實(shí)驗(yàn)室試劑用水中，再加入180 μL 10 mmol/L的ZnSO4溶液，使每毫升的5 g/L酚紅中含0.1 mmol/L的ZnSO4,使將A液pH值調(diào)至7.8±0.1，Carba NP B液為A液+6 mg/mL亞胺培南，A、B液的顏色均為紅色或橘紅色。分別在2支離心管(a管、b管)中加入100 μL細(xì)菌蛋白提取試劑，2支管中分別加入1～2個(gè)菌落的待測(cè)菌(空白對(duì)照組只含細(xì)菌蛋白提取試劑，不含待測(cè)菌)，渦旋振搖5 s后在a管中加入100 μL A液，b管中加入100 μL B液，將a管和b管均置入(35±2)℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，每30 min觀察一次溶液顏色是否變化。判斷結(jié)果參照2018版CLSI標(biāo)準(zhǔn)[5]。

1.3.3 PCR擴(kuò)增耐藥基因 運(yùn)用煮沸法提取菌株DNA模板，PCR擴(kuò)增以下耐藥基因：KPC、SME、IMI、NDM-1、IMP、SIM、VIM、OXA-48，引物序列參照相關(guān)文獻(xiàn)[6-8]，由上海生工公司合成。擴(kuò)增體系為25 μL體積，包括2×PCR Master Mix 12.5 μL、DNA模板2 μL、100 μmol/L上游引物0.1 μL、100 μmol/L下游引物0.1 μL、加PCR超純水至25 μL。PCR擴(kuò)增條件：94℃ 3 min預(yù)變性，94℃ 30 s變性，退火溫度(KPC、SME、IMI、NDM-1、IMP、SIM、VIM、OXA-48 59、45、47、58、50、53、54、56℃) 30 s退火，72℃ 1 min延伸，35個(gè)循環(huán)，72℃ 10 min再延伸。取5 μL的PCR產(chǎn)物加入1.2%的瓊脂糖凝膠孔中，在0.5×TBE電泳液中電泳， 在凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。將PCR擴(kuò)增陽(yáng)性的產(chǎn)物送上海生工純化并測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用MegAlign軟件與基因庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)。

1.3.4 同源性分析

1.3.4.1 多位點(diǎn)序列分型 (multilocus sequence typing,MLST) 參照MLST官方網(wǎng)站 (http://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html) 上提供的KPN的7個(gè)管家基因(gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB、tonB)序列合成引物，擴(kuò)增體系同1.3.3，擴(kuò)增條件為94℃ 5 min預(yù)變性，94℃ 50 s變性，50℃ 30 s退火，72℃ 50 s延伸，30個(gè)循環(huán)，72℃ 10 min再延伸。PCR產(chǎn)物送上海生工公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與MLST數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，得到等位基因編碼，將所得編碼按照gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB、tonB管家基因順序組合，在MLST數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)比查找完全符合的ST型。

1.3.4.2 腸桿菌科基因間一致重復(fù)序列PCR(enterobacterial repetitive intergenic consensus-PCR, ERIC-PCR) 基因引物序列為：ERIC-1: 5’-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3’；ERIC-2: 5’-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3’。擴(kuò)增體系同1.3.3，擴(kuò)增條件為94℃ 3 min 預(yù)變性，94℃ 30 s變性，55℃ 30 s退火，72℃ 1 min延伸，35個(gè)循環(huán)，72℃ 10 min再延伸。PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)為：如果菌株屬于同一類型，則電泳條帶的數(shù)量和位置相同[9]。

2 結(jié)果

2.1 菌株資料 22株CRKP主要分離自新生兒科及ICU，分別占31.81%、27.27%，其余為腦血管科(18.18%)、其他科室(呼吸內(nèi)科、胸外科、全科病房、血液內(nèi)科、腎內(nèi)科各占4.55%)。22例CRKP感染患者中，11例年齡≥60歲，6例年齡<28 d；呼吸道感染者13例；所有患者均患2種或以上基礎(chǔ)疾病；20例患者住院期間有過≥2項(xiàng)的侵入性操作或治療；20例患者住院期間使用抗菌藥物種類≥2種。見表1。

表1 22例CRKP感染患者的基本資料

基礎(chǔ)疾病包括：1肺部感染，2呼吸衰竭，3 AECOPD，4氣胸，5肺挫傷，6肋骨骨折，7雙側(cè)胸腔積液，8胸腔閉式引流術(shù)后，9急性呼吸窘迫綜合征，10冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病，11陳舊性心肌梗死，12高血壓，13腦梗死，14腦出血，15腦疝，16重度顱腦損傷，17繼發(fā)性癲癇，18化膿性腦膜炎，19梗阻性腦積水，20帕金森綜合征，21阿爾茨海默病，22慢性腎臟病，23急性腎衰竭，24泌尿系統(tǒng)感染，25糖尿病，26重癥急性胰腺炎，27急性梗阻性化膿性膽管炎，28低蛋白血癥，29貧血，30失血性休克，31感染性休克，32膿毒血癥，33 MODS，34右股骨粗隆間骨折，35左髖關(guān)節(jié)置換，36壓瘡，37早產(chǎn)兒，38低出生體重兒，39新生兒呼吸窘迫綜合癥，40先天性心臟病，41新生兒窒息，42新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎，43小腸穿孔，44彌漫性腹膜炎，45新生兒高膽紅素血癥，46新生兒敗血癥，47慢性肺心病，48慢性心力衰竭，49心律失常；侵入性操作或治療包括：A氣管插管/切開，B機(jī)械通氣，C深靜脈置管，D留置導(dǎo)尿管，E留置胃管，F(xiàn)留置引流管，G使用肛管，H手術(shù)，I針灸，J胸腔穿刺術(shù)，K腹腔穿刺術(shù)，L腰椎穿刺術(shù)，M骨髓穿刺術(shù)，N使用纖維支氣管鏡，O血液透析，P血漿置換，Q輸血；抗菌藥物包括：a頭孢呋辛鈉，b頭孢孟多酯鈉，c頭孢噻肟鈉，d頭孢他啶，e拉氧頭孢，f頭孢米諾鈉，g頭孢曲松鈉/他唑巴坦鈉，h頭孢哌酮鈉/他唑巴坦鈉，i青霉素鈉，j氟氯西林鈉，k阿莫西林鈉/克拉維酸鉀，l哌拉西林鈉/舒巴坦，m哌拉西林/他唑巴坦，n左氧氟沙星，o莫西沙星，p美羅培南，q亞胺培南/西司他丁，r萬古霉素，s替加環(huán)素，t甲硝唑，u伏立康唑，v醋酸卡泊芬凈

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 K-B法和微量肉湯稀釋法結(jié)果顯示，22株CRKP對(duì)IPM、MEM及ETP均耐藥。抑菌圈直徑和MIC值見表2。

2.4 碳青霉烯酶檢測(cè)結(jié)果 采用MHT和Carba NP試驗(yàn)檢測(cè)CRKP碳青霉烯酶，結(jié)果MHT陽(yáng)性13株(K1-K9，K11-K14)，Carba NP試驗(yàn)陽(yáng)性14株(K1-K14)。見圖1。

表2K-B法和微量稀釋法對(duì)22株CRKP藥敏檢測(cè)結(jié)果

Table2Antimicrobial susceptibility testing results of 22 strains of CRKP detected by Kirby-Bauer disk diffusion and broth microdilution method

菌株編號(hào)抑菌圈直徑(mm)IPMMEMETPMIC(μg/mL)IPMMEMETPK1866512256256K21366>512>512>512K31666256128256K41266512512>512K51366643232K68661688K7116625664256K81366>512>512>512K91666>512>512>512K10136632128128K111919152561632K12666>512256128K131166256128256K141566256256512K15666643216K161514132563232K1716161451264128K18131110512128256K191716142561632K201615125121616K211714125123232K22181210 51232128

A:MHT陽(yáng)性結(jié)果,ATCC 25922為陰性對(duì)照，160109043為陽(yáng)性對(duì)照，171205332為試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性菌株；B:Carba NP試驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果

圖1CRKP碳青霉烯酶檢測(cè)結(jié)果

Figure1CRKP carbapenemase detection results

2.5 PCR擴(kuò)增耐藥基因及測(cè)序結(jié)果 PCR擴(kuò)增碳青霉烯酶檢測(cè)陽(yáng)性菌株，經(jīng)測(cè)序結(jié)果顯示，14株產(chǎn)酶菌株均攜帶KPC-2基因，K12菌株同時(shí)攜帶NDM-1基因。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖2。所有菌株均未擴(kuò)增出SME、IMI、IMP、SIM、VIM及OXA-48基因。

A:KPC基因;B:NDM-1基因;M：2 000 bp DNA Marker；陰：陰性對(duì)照；陽(yáng)：陽(yáng)性對(duì)照

圖2KPC基因和NDM-1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

Figure2Electrophoresis map of PCR amplification pro-ducts of KPC gene and NDM-1 gene

2.6 同源性分析 按MLST法22株CRKP可分為ST11、ST875、ST1964和ST571四種序列型，其中K1～K14為ST11型，K15～K17和K19～K21為ST875型，K18為ST1964型，K22為ST571型，MLST結(jié)果詳見表3。按ERIC-PCR法分型可分為A、B、C三種類型， 其中K1～K14及K18為A型， K15～K17和K19～K21為B型，K22為C型，見圖3。

2.7 菌株來源科室、住院時(shí)間及其同源性檢測(cè)結(jié)果 分型結(jié)果相同的菌株中K1～K6同屬ICU，K7～K10同屬腦血管外科，其中K1與K2，K2與K3，K3與K5，K8與K9，K9與K10均有共同住院時(shí)間，K8與K9病床相連，且患者存在轉(zhuǎn)科情況，K2、 K8均由腦血管外科轉(zhuǎn)入ICU，K13、K14分別從ICU轉(zhuǎn)入血液內(nèi)科、腎內(nèi)科。新生兒科K15與K16及K17均有共同住院時(shí)間，K19、K20和K21均有共同住院時(shí)間，K20與K21有共同住院時(shí)間， 見表4。

表3 22株CRKP MLST結(jié)果

M：2 000 bp DNA Marker

試驗(yàn)編號(hào)科室患者住院時(shí)間?耐藥基因MLST型ERIC-PCR分型K1ICU12月1日—2月27日KPC-2ST11AK2ICU2月5日—7月3日KPC-2ST11AK3ICU 4月5日—10月9日KPC-2ST11AK4ICU 10月8日—20日KPC-2ST11AK5ICU 9月21日—12月11日KPC-2ST11AK6ICU 10月30日—12月9日KPC-2ST11AK7腦血管科 1月24日—2月25日KPC-2ST11AK8腦血管科 4月1日—5月15日KPC-2ST11AK9腦血管科 4月20日—5月9日KPC-2ST11AK10腦血管科 5月8日—6月22日KPC-2ST11AK11胸外科 1月31日—3月9日KPC-2ST11AK12全科 8月18日—28日KPC-2、NDM-1ST11A

續(xù)表4 (Table 4， Continued)

*: K1患者住院時(shí)間跨2016—2017年，其余患者住院時(shí)間均為2017年;-：未檢測(cè)

3 討論

KPN碳青霉烯酶可水解包括碳青霉烯類抗生素在類的β-內(nèi)酰胺類抗生素，如頭孢菌素類、青霉素類及單環(huán)酰胺類，導(dǎo)致菌株對(duì)多種抗菌藥物耐藥，但其不能水解頭霉素類抗生素。中國(guó)細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)[10]顯示，2015年KPN對(duì)MEM的耐藥率為2.90%，對(duì)IPM的耐藥率為3.00%，僅過兩年，KPN對(duì)MEM及IPM的耐藥率分別上升至24.00%、20.90%，上升幅度在5倍以上，而感染CRKP后病死率高達(dá)47.90%[11]。本研究中22株CRKP對(duì)IPM、MEM、ETP的耐藥率均達(dá)100%，對(duì)臨床其他常用的抗菌藥物也高度耐藥。建議臨床醫(yī)生應(yīng)根據(jù)患者的癥狀和體征，并結(jié)合藥敏結(jié)果，嚴(yán)格選擇抗菌藥物，避免濫用抗菌藥物。22株CRKP中有7株分離自新生兒科，6株分離自ICU；22例患者中，11例年齡≥60歲，6例年齡<28 d；所有患者均患2種或更多基礎(chǔ)疾病，20例患者住院期間有過≥2項(xiàng)的侵入性操作或治療，20例患者住院期間使用抗菌藥物種類≥2種，提示病情重、基礎(chǔ)疾病多、免疫力低、有創(chuàng)操作和(或)無創(chuàng)操作多、長(zhǎng)期使用抗菌藥物和(或)聯(lián)用抗菌藥物的患者可能易感染CRKP，與巴西學(xué)者Da silva 等[12]的研究結(jié)論一致。對(duì)具有上述特征的患者，醫(yī)務(wù)人員應(yīng)給予高度關(guān)注，盡量避免醫(yī)院感染的發(fā)生。22株CRKP中13株從呼吸道標(biāo)本中檢出，表明細(xì)菌容易侵入呼吸道，引起呼吸系統(tǒng)感染，臨床醫(yī)生應(yīng)加強(qiáng)患者氣道管理，及時(shí)送檢標(biāo)本，爭(zhēng)取做到早發(fā)現(xiàn)，早防控，早治療。

迄今為止，已發(fā)現(xiàn)24種KPN的KPC亞型(KPC-1和KPC-2后被證實(shí)為同一型別)，其中KPC-2和KPC-3是國(guó)內(nèi)外最常見型別，已在全球多個(gè)國(guó)家暴發(fā)流行[13-14]。本研究中，14株產(chǎn)酶菌株均攜帶KPC-2耐藥基因，其中K12同時(shí)攜帶NDM-1基因，提示該院碳青霉烯酶基因存在多態(tài)性，但同時(shí)攜帶KPC-2及NDM-1基因的菌株表現(xiàn)出的耐藥性與其他菌株無明顯差異，可能是NDM-1基因并未表達(dá)或僅僅低表達(dá)。攜帶碳青霉烯酶耐藥基因的14株CRKP，MLST分類屬于ST11型，與中國(guó)CRKP菌株的主要流行基因型和克隆型一致[15]。該院還存在ST875型CRKP的克隆流行，此型全部分布于新生兒科，與祝俊英等[16]研究結(jié)果不同，可能與不同地區(qū)抗菌藥物使用差異有關(guān)，且新生兒科的7株CRKP產(chǎn)酶試驗(yàn)均陰性，提示可能存在其他耐藥機(jī)制。此外該院還存在ST1964和ST571兩種序列型，但尚未在該院流行。

研究[17]證實(shí)，CRKP的耐藥基因可位于以下基因元件上：包括可移動(dòng)的質(zhì)粒、整合子及插入序列等，可在不同患者、病區(qū)、醫(yī)院、地區(qū)，甚至不同菌種間進(jìn)行傳播，造成大范圍的流行。本研究同源性分析發(fā)現(xiàn)，K1～K14 MLST均為ST11型，ERIC-PCR分型均為A型；K15～K17和K19～K21 MLST均為ST875型， ERIC-PCR分型均為B型；K22菌株在兩種同源性分析方法中均獨(dú)立成一型，分別為ST571型和C型，以上菌株兩種同源性分析方法結(jié)果一致。分型結(jié)果相同的菌株中K1～K6同屬ICU，K7～K10同屬腦血管外科，其中K1與K2，K2與K3，K3與K5，K8與K9，K9與K10均有共同住院時(shí)間，且K8與K9病床相連，K2是由腦血管外科轉(zhuǎn)入，與腦血管外科的K7有共同住院時(shí)間，K8因病情加重后轉(zhuǎn)入ICU，與ICU的K2與K3均有共同住院時(shí)間，血液內(nèi)科的K13是由ICU轉(zhuǎn)入的，與ICU的K3有共同住院時(shí)間，而腎內(nèi)科的K14是由ICU轉(zhuǎn)入的，與ICU的K3、K5均有共同住院時(shí)間，提示該院ICU、腦血管外科、腎內(nèi)科和血液內(nèi)科病區(qū)間存在ST11型CRKP的克隆傳播。新生兒科分型相同的K15～K17和K19～K21中，K15與K16及K17均有共同住院時(shí)間，K19與K20和K21均有共同住院時(shí)間，而K20與K21有共同住院時(shí)間，說明2017年該院新生兒科存在ST875型CRKP暴發(fā)流行。針對(duì)此次ST11型和ST875型CRKP在該院的暴發(fā)流行，通過及時(shí)與相關(guān)科室溝通，隔離感染患者，加強(qiáng)醫(yī)務(wù)、保潔等人員的醫(yī)院感染防控意識(shí)，加強(qiáng)手衛(wèi)生管理，及清潔和消毒床單元和共用物品，已基本控制該院CRKP的進(jìn)一步播散。

近年來，CRKP在全球各地散發(fā)和(或)流行時(shí)有發(fā)生，甚至在曾經(jīng)檢出率較低的歐洲國(guó)家也出現(xiàn)了流行，對(duì)CRKP的監(jiān)測(cè)與防控仍是一項(xiàng)非常重要的工作。臨床醫(yī)生應(yīng)了解CRKP的耐藥機(jī)制及分子流行病學(xué)特點(diǎn)，做好醫(yī)院感染防控，減少CRKP的傳播。