大腸埃希菌質(zhì)粒介導(dǎo)的blaNDM-1基因耐藥及傳播性研究

文江雄, 鄔小萍, 張 偉, 劉 洋, 朱 瀅, 石白茹, 胡大利, 向天新

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院 1. 感染科； 2. 呼吸科； 3. 檢驗(yàn)科，江西 南昌 330006)

碳青霉烯類抗生素是目前治療腸桿菌科類細(xì)菌重度感染的一線用藥，然而近些年來，隨著碳青霉烯類抗生素的廣泛使用，不斷出現(xiàn)耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌(CRE)。這類細(xì)菌往往對(duì)包括碳青霉烯類在內(nèi)的多種不同類型抗菌藥物耐藥，從而導(dǎo)致臨床治療失敗，嚴(yán)重威脅患者生命[1-2]。大腸埃希菌是目前臨床常見的條件致病菌，在檢出的革蘭陰性桿菌中所占比例較高。CHINET監(jiān)測顯示，2007年大腸埃希菌對(duì)亞胺培南均敏感，而2014年大腸埃希菌對(duì)亞胺培南的耐藥率升高至0.9%[3]。細(xì)菌產(chǎn)碳青霉烯酶是目前腸桿菌科細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥的主要原因。本研究對(duì)南昌大學(xué)某附屬醫(yī)院碳青霉烯類抗生素不敏感的大腸埃希菌中blaNDM-1基因攜帶情況及耐藥現(xiàn)狀進(jìn)行研究，旨在了解其傳播規(guī)律，為遏制該類耐藥菌株在醫(yī)院流行提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 菌株來源 收集2016年1—12月南昌大學(xué)某附屬醫(yī)院各科室的臨床標(biāo)本，從中分離92株對(duì)碳青霉烯類抗生素不敏感的大腸埃希菌(亞胺培南或美羅培南≥2 μg/mL，剔除重復(fù)菌株)作為試驗(yàn)菌株。試驗(yàn)菌株患者均無國外旅游史。標(biāo)準(zhǔn)菌株為肺炎克雷伯菌ATCC 700603和大腸埃希菌ATCC 25922，疊氮鈉耐藥的大腸埃希菌J53為接合試驗(yàn)受體菌。

1.2 儀器和試劑 2×Taq PCR Master Mix酶，DNA Marker購自大連TaKaRa公司，亞胺培南購自美國Amresco公司，美羅培南(10 μg)藥敏紙片購自英國Oxoid公司，瓊脂糖購自上海生工生物技術(shù)有限公司，尼龍膜購自Amersham公司，Southern blot雜交試劑盒購自美國羅氏公司，切膠回收試劑盒與質(zhì)粒小量提取試劑盒購自美國Axygen公司，PCR儀購自德國Eppendorf公司，電泳儀購自美國Bio-Rad公司，凝膠成像儀購自上海精科實(shí)業(yè)有限公司，脫色搖床購自上海琪特分析儀器有限公司，恒溫水浴振蕩器購自上海重逢科學(xué)儀器有限公司，Vitek 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定儀購自法國生物梅里埃生物公司，相關(guān)擴(kuò)增引物均參照有關(guān)文獻(xiàn)[4-5]設(shè)計(jì)，由上海生工生物技術(shù)有限公司幫助合成。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1blaNDM-1基因及常見碳青霉烯酶基因檢測 采用煮沸法提取試驗(yàn)菌株DNA，應(yīng)用NDM-1引物進(jìn)行blaNDM-1基因擴(kuò)增，blaNDM-1陽性菌株再進(jìn)行碳青霉烯酶耐藥基因(blaKPC-2、blaSPM、blaGIM、blaVIM、blaIMP、blaOXA-48)篩查。PCR引物序列見表1。PCR擴(kuò)增體系為：上游引物2 μL，下游引物2 μL，模板2 μL，ddH2O 19 μL；2×Taq PCR Master Mix 25 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，共29個(gè)循環(huán)， 72℃延伸10 min。最后將擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢驗(yàn)，將試驗(yàn)出現(xiàn)的陽性條帶PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送蘇州泓訊生物科技有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果采用美國生物信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)中的BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行分析后判斷檢測結(jié)果是否準(zhǔn)確。

表1常見碳青霉烯酶基因的相關(guān)PCR引物序列

Table1PCR primer sequences of common carbapenemase genes

引物名稱引物序列(5’-3’)擴(kuò)增產(chǎn)物長度(bp)NDM-1F: GGCGGAATGGCTCATCACGAR: CGCAACACAGCCTGACTTTC287[4]KPC-2F: GCTACACCTAGCTCCACCTTCR: ACAGTGGTTGGTAATCCATGC989[5]VIMF: TCCGACAGTCAGCGAAATR: GCAGCACCAGGATAGAAGA435[5]IMPF: ATGGTTTGGTGGTTCTTGR: TAATTTGGCGGACTTTGG446[5]OXA-48F: CGCATCTTGTTGTCCAAGTGR: TCGAGCATCAGCATTTTGTC1 012[5]SPMF: CTGCTTGGATTCATGGGCGCGR: CCTTTTCCGCGACCTTGATCG786[5]GIMF: CCTGTAGCGTTGCCAGCTTTAR: CAGCCCAAGAGCTAATTGAGG562[5]

1.3.2 接合試驗(yàn) 受體菌為對(duì)疊氮鈉耐藥的大腸埃希菌J53，分別將供體菌株和受體菌株接種至普通MH平板，37℃孵育18 h。從MH平板上挑取適量新鮮菌落(供體菌、受體菌)分別接種于含有5 mL LB肉湯培養(yǎng)基的玻璃試管中，37℃孵育18 h。 之后分別吸取400 μL供體菌、200 μL受體菌加至含有800 μL LB肉湯培養(yǎng)基的玻璃試管中，37℃孵育18 h，同時(shí)將供體菌和受體菌分別接種于篩選平板(0.5 μg/mL亞胺培南+180 μg/mL疊氮鈉)，作為空白對(duì)照。最后取100 μL經(jīng)過上述培養(yǎng)的菌液接種于篩選平板(0.5 μg/mL亞胺培南+180 μg/mL疊氮鈉)，37℃孵育18 h，采用Vitek 2 Compact 全自動(dòng)微生物分析儀對(duì)篩選平板上生長良好的接合后的菌株進(jìn)行菌株鑒定，應(yīng)用PCR法檢測blaNDM-1基因。

1.3.3 藥敏試驗(yàn) 對(duì)攜帶blaNDM-1基因的大腸埃希菌及其接合子采用Vitek 2 Compact 全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，藥敏結(jié)果參照2013版美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀。

1.3.4 Southern blot 制備NDM-1探針，用NDM-1引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，切膠回收產(chǎn)物作為DNA模板，然后與DIG-High Prime進(jìn)行目的DNA的地高辛標(biāo)記，按質(zhì)粒試劑盒說明提取質(zhì)粒，進(jìn)行質(zhì)粒Southern blot雜交，即質(zhì)粒瓊脂糖凝膠(0.8%)電泳后轉(zhuǎn)膜、烘干、預(yù)雜交、雜交、洗膜、顯色及保存圖片。

1.3.5 碳青霉烯酶表型檢測 采用改良碳青霉烯酶滅活試驗(yàn)[6](modified carbapenem inactivation method，mCIM)檢測碳青霉烯酶。取1 μL過夜培養(yǎng)的純菌落于2 mL TSB肉湯中，輕輕振蕩10 s，將含10 μg美羅培南的無菌紙片浸沒于該TSB菌液中，35℃孵育4 h，孵育結(jié)束時(shí)，先將生理鹽水制備的0.5麥?zhǔn)蠁挝坏拇竽c埃希菌ATCC 25922菌懸液涂布于MH瓊脂平板上室溫放置5 min，再將美羅培南紙片從TSB菌液中取出，將紙片貼于涂布有大腸埃希菌ATCC 25922的MH瓊脂平板上，35℃過夜培養(yǎng)。結(jié)果判讀：若抑菌圈直徑≤18 mm，則mCIM試驗(yàn)陽性，受測菌產(chǎn)碳青霉烯酶，反之，抑菌圈直徑≥19 mm，則不能確定是否產(chǎn)碳青霉烯酶。

2 結(jié)果

2.1blaNDM-1基因檢測結(jié)果 92株碳青霉烯類抗生素不敏感的大腸埃希菌，其中2株攜帶blaNDM-1基因的大腸埃希菌，攜帶率2.2%。對(duì)此2株菌進(jìn)行blaKPC-2、blaSPM、blaGIM、blaVIM、blaIMP、blaOXA-48碳青霉烯酶基因檢測，未發(fā)現(xiàn)其同時(shí)攜帶此類基因。2株blaNDM-1基因陽性的大腸埃希菌，一株來自該院傳染科(患者女性，76歲，中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染)，另一株來自該院泌外科(患者男性，50歲，腎結(jié)石)；均分離自尿標(biāo)本。blaNDM-1基因陽性的大腸埃希菌電泳結(jié)果見圖1。

注：+、-分別為陽性、陰性對(duì)照，M為Marker DNA 2 000(從上至下共6條帶：2 000、1 500、1 000、700、400、200 bp)，E1、E2為大腸埃希菌臨床株

圖1大腸埃希菌blaNDM-1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

Figure1Electrophoresis map of PCR amplification pro-ducts ofE.coliblaNDM-1gene

2.2 接合試驗(yàn)結(jié)果 2株blaNDM-1陽性大腸埃希菌(E1、E2)分別與大腸埃希菌J53菌株進(jìn)行接合試驗(yàn)，將接合子接種在篩選MH平板上(0.5 μg/mL亞胺培南+180 μg/mL疊氮鈉)，發(fā)現(xiàn)其中1株在平板生長。經(jīng)Vitek 2 Compact 全自動(dòng)微生物分析儀鑒定為大腸埃希菌。提取受體菌DNA行blaNDM-1基因PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳可見明顯陽性條帶，說明有1株blaNDM-1陽性大腸埃希菌與大腸埃希菌J53接合成功，為E3(E1為供體菌)。

2.3 Southern Blot結(jié)果 根據(jù)質(zhì)粒小量提取試劑盒的操作說明提取2株blaNDM-1陽性大腸埃希菌的質(zhì)粒，采用質(zhì)粒Southern blot雜交試驗(yàn)技術(shù)進(jìn)行blaNDM-1基因質(zhì)粒定位。2株blaNDM-1陽性大腸埃希菌的質(zhì)粒經(jīng)雜交、染色后均顯色，說明blaNDM-1基因均位于耐藥菌株質(zhì)粒上。提取接合子的質(zhì)粒進(jìn)行Southern blot雜交，接合子也有質(zhì)粒顯色，說明大腸埃希菌blaNDM-1質(zhì)粒成功導(dǎo)入大腸埃希菌J53內(nèi)，質(zhì)粒Southern blot結(jié)果見圖2。

圖2blaNDM-1陽性大腸埃希菌質(zhì)粒與接合子質(zhì)粒Southern blot圖

Figure2Southern blot map ofblaNDM-1positiveE.coliplasmid and conjugate plasmid

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 將2株blaNDM-1陽性大腸埃希菌(E1、E2)及接合子(E3)采用Vitek 2 Compact 全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)，2株blaNDM-1陽性大腸埃希菌對(duì)大多數(shù)臨床抗菌藥物均耐藥，僅E2對(duì)阿米卡星敏感，對(duì)氨曲南、妥布霉素中介，而接合子E3則獲得了與供體菌E1相類似的藥敏結(jié)果。稍有改變的是接合子E3較供體菌E1對(duì)阿米卡星敏感，慶大霉素的MIC值稍有下降，對(duì)妥布霉素及氨曲南由耐藥變?yōu)橹薪椤Ｒ姳?。

2.5 碳青霉烯酶表型結(jié)果 mCIM檢測結(jié)果顯示，2株blaNDM-1基因陽性大腸埃希菌及接合子mCIM試驗(yàn)的抑菌圈直徑均<18 mm， 表明均產(chǎn)NDM-1型的碳青霉烯酶，結(jié)果見圖3。

表2blaNDM-1陽性菌株與接合子藥敏試驗(yàn)結(jié)果(μg/mL)

Table2Antimicrobial susceptibility testing results ofblaNDM-1positive strains and conjugates(μg/mL)

抗菌藥物E1E2E3氨芐西林>32(耐藥) >16(耐藥)>32(耐藥)氨芐西林/舒巴坦>32(耐藥) >16(耐藥)-哌拉西林/他唑巴坦 >128(耐藥) >64(耐藥)>64(耐藥)頭孢他啶>64(耐藥) >64(耐藥)>64(耐藥)頭孢吡肟>64(耐藥) >64(耐藥)>64(耐藥)頭孢唑林>64(耐藥) >64(耐藥)>64(耐藥)頭孢哌酮/舒巴坦 6(耐藥) 6(耐藥)6(耐藥)氨曲南 >64(耐藥)≤8(中介)≤8(中介)美羅培南>16(耐藥)>8(耐藥)>16(耐藥)亞胺培南>16(耐藥)>8(耐藥)>16(耐藥)厄他培南>8(耐藥)>8(耐藥)>8(耐藥)阿米卡星>64(耐藥)≤8(敏感)≤8(敏感)慶大霉素>16(耐藥)>8(耐藥)>8(耐藥)妥布霉素>16(耐藥)8(中介)8(中介)環(huán)丙沙星>4(耐藥)>4(耐藥)>4(耐藥)左氧氟沙星>8(耐藥)>4(耐藥)>8(耐藥)

-：未檢測

注：左側(cè)為試驗(yàn)菌株mCIM陽性結(jié)果，右側(cè)為肺炎克雷伯菌ATCC 700603(陰性對(duì)照)

圖3攜帶blaNDM-1基因的大腸埃希菌mCIM檢測結(jié)果

Figure3Detection of mCIM inE.colicarryingblaNDM-1gene

3 討論

目前臨床上治療革蘭陰性桿菌感染最有效的β-內(nèi)酰胺類藥物主要為碳青霉烯類抗生素，但隨著該類抗生素的過度使用，甚至是濫用，導(dǎo)致對(duì)該類抗生素耐藥的菌株不斷出現(xiàn)。其主要耐藥機(jī)制是產(chǎn)碳青霉烯酶，能夠水解該類抗生素[7]。在腸桿菌科細(xì)菌中常見的三大碳青霉烯酶有KPC、NDM、OXA-48[8]，NDM酶屬于Ambler分類中的B類酶。該酶首次發(fā)現(xiàn)于2010年1例在印度新德里住院后返回瑞典患者的分離菌株，最早出現(xiàn)在多重耐藥肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌中[9]。我國于2013年首次報(bào)道攜帶blaNDM-1基因的大腸埃希菌[10]。本研究收集了該院2016年1—12月92株對(duì)碳青霉烯類抗生素不敏感的大腸埃希菌，發(fā)現(xiàn)2株攜帶blaNDM-1基因。大腸埃希菌是臨床上造成重度感染的常見革蘭陰性菌之一，尤其是攜帶blaNDM-1基因產(chǎn)碳青霉烯酶而導(dǎo)致對(duì)臨床上多種抗菌藥物不敏感，給治療帶來了極大的困難。

耐藥基因可通過細(xì)菌的質(zhì)粒或整合子等可轉(zhuǎn)移的移動(dòng)元件實(shí)現(xiàn)細(xì)菌耐藥的水平傳播，這也是近幾年細(xì)菌耐碳青霉烯類抗生素增多的原因之一[11]。研究[12-14]表明，blaNDM-1基因絕大多數(shù)存在于耐藥菌株的質(zhì)粒上，而質(zhì)粒是染色體以外重要的遺傳因子，具有自我復(fù)制及轉(zhuǎn)移能力。正是這種自我復(fù)制和水平轉(zhuǎn)移能力使得存在于質(zhì)粒中的blaNDM-1基因可以在細(xì)菌間無抗菌藥物選擇壓力下進(jìn)行水平傳播，為細(xì)菌耐藥性的播散提供了高效的傳播載體。本研究在該院發(fā)現(xiàn)2株攜帶blaNDM-1基因的大腸埃希菌，通過與大腸埃希菌J53的接合試驗(yàn)及blaNDM-1基因Southern blot基因定位分析，驗(yàn)證了此2株攜帶的blaNDM-1基因均位于細(xì)菌的質(zhì)粒上。其中1株大腸埃希菌攜帶的blaNDM-1基因成功接合至大腸埃希菌J53中，說明blaNDM-1基因可通過質(zhì)粒介導(dǎo)的傳播方式在不同菌株間傳播。本研究發(fā)現(xiàn)攜帶blaNDM-1基因的大腸埃希菌，在對(duì)碳青霉烯類抗生素不敏感的大腸埃希菌中的比率為2.2%。雖然未造成嚴(yán)重的感染性暴發(fā)事件，但是其通過質(zhì)粒介導(dǎo)的水平傳播方式，隨時(shí)有可能造成大范圍的暴發(fā)流行，應(yīng)當(dāng)引起重視，做好相應(yīng)的防控措施。

賈元春等[15]研究發(fā)現(xiàn)，耐碳青霉烯類大腸埃希菌對(duì)臨床大多數(shù)抗菌藥物均耐藥，僅少數(shù)對(duì)米諾環(huán)素和阿米卡星敏感。其中對(duì)碳青霉烯類耐藥的大腸埃希菌多數(shù)攜帶blaNDM-1基因，表現(xiàn)為多重耐藥。該院發(fā)現(xiàn)的2株攜帶blaNDM-1基因的大腸埃希菌表現(xiàn)出了與該研究類似的耐藥特征。俞鳳等[16]對(duì)1株攜帶blaNDM-1基因非脫羧勒克菌的研究中發(fā)現(xiàn)，攜帶blaNDM-1基因的耐藥菌株與大腸埃希菌J53接合成功后，接合子可以獲得與供體菌相似的耐藥譜。本研究中通過接合試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，接合子獲得了與供體菌相類似的耐藥特征，稍有改變的是接合子對(duì)阿米卡星敏感，對(duì)慶大霉素的MIC值稍有下降，對(duì)妥布霉素及氨曲南由耐藥變?yōu)橹薪椤?duì)于受體菌大腸埃希菌J53獲得攜帶blaNDM-1基因的質(zhì)粒后，從而獲得與供體菌相類似的耐藥譜以及細(xì)小的耐藥差異的機(jī)制目前尚不清楚，需要進(jìn)一步深入研究。

既往改良的Hodge試驗(yàn)只對(duì)KPC型A類碳青霉烯酶和OXA型D類碳青霉烯酶具有較高的檢測效果，然而對(duì)金屬酶類的IMP、VIM、NDM-1檢測效率不高[17]。本研究采用的mCIM試驗(yàn)?zāi)軌驒z測所有類型的碳青霉烯酶[18]。本研究中的2株攜帶blaNDM-1基因的大腸埃希菌及接合子mCIM試驗(yàn)全部陽性，提示均產(chǎn)B類NDM-1型碳青霉烯酶。

綜上所述，南昌大學(xué)某附屬醫(yī)院已存在攜帶blaNDM-1耐藥基因并產(chǎn)NDM-1型碳青霉烯酶的大腸埃希菌，且介導(dǎo)了該類菌株對(duì)臨床絕大多數(shù)抗菌藥物耐藥。研究還發(fā)現(xiàn)blaNDM-1基因可以通過質(zhì)粒介導(dǎo)的方式傳播耐藥性，有可能導(dǎo)致耐藥菌醫(yī)院感染暴發(fā)，應(yīng)當(dāng)引起重視，加大該類耐藥菌株的監(jiān)測力度，避免出現(xiàn)耐藥菌醫(yī)院感染暴發(fā)事件。