實(shí)時(shí)熒光RPA 快速檢測(cè)犬冠狀病毒方法的建立

熊 煒 ,蔡一村 ,王楷宬 ,張 強(qiáng) ,黃保續(xù) ,田楨干 ,林穎崢,李 健

(1.上海市檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院,上海浦東200135 ;2.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心,山東青島 266032)

犬冠狀病毒(Canine coronavirus,CCV)是一種以胃腸炎為主要癥狀的高度接觸性傳染病,臨床上以犬嚴(yán)重脫水、嘔吐、腹瀉和血便為主要特征,致死率較低,但與其他傳染病混合感染時(shí),死亡率提高,對(duì)幼犬危害嚴(yán)重,是養(yǎng)犬業(yè)危害較大的疫病之一[1-4]。CCV 為代表的冠狀病毒極易變異,導(dǎo)致冠狀病毒血清型眾多,且新的血清型還在不斷出現(xiàn),如嚴(yán)重急性呼吸綜合征(Severe acute respiratory syndrome,SARS)的病原就是一種新型冠狀病毒。由于寵物飼養(yǎng)者數(shù)量日益增多,犬的健康與否與人類健康密切相關(guān),因此,研制犬冠狀病毒快速檢測(cè)技術(shù)、縮短檢測(cè)周期,對(duì)控制犬冠狀病毒的傳播具有重要的意義[5-6]。除病毒分離、電鏡檢測(cè)、ELISA 等方法外,反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RTPCR)方法是目前檢測(cè)CCV 最常用的方法,此外還有膠體金、實(shí)時(shí)熒光RT-PCR 等多種檢測(cè)方法[7-9]。實(shí)時(shí)熒光重組酶聚合酶擴(kuò)增(real-time recombinase Polymerase Amplification assay,real-time RPA)是一種新型的、可以替代傳統(tǒng)PCR 檢測(cè)技術(shù)的核酸快速檢測(cè)方法,它能夠在20 min 內(nèi)完成常溫下核酸的擴(kuò)增和檢測(cè),檢測(cè)設(shè)備小巧、便攜,特別適合野外及檢疫現(xiàn)場(chǎng)使用。本研究建立了實(shí)時(shí)熒光RPA 檢測(cè)CCV 的方法,并對(duì)方法的特異性、敏感性和穩(wěn)定性進(jìn)行了驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 TRIzol 購(gòu)自Invitrogen 公司;Taq酶、AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA 酶抑制劑、dNTP、隨機(jī)引物、DNA Marker(DL-2 000),購(gòu)自TaKaRa 公司;RPA 檢測(cè)試劑購(gòu)自英國(guó)TwistDx Inc 公司;DNA 抽提試劑盒(QIAamp DNA Blood Mini Kits)購(gòu)自QIAGEN 公司;磷酸鹽緩沖液(PBS,pH 值7.4)購(gòu)自Gibico 公司;其他試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑有限公司。

1.2 病毒樣品來(lái)源及處理 CCV 病毒、陽(yáng)性核酸和組織病料為本室保存,來(lái)自上?？诎度刖车膶櫸锛吧虾５貐^(qū)寵物醫(yī)院的病犬,組織病料包括病犬的血液、尿液、糞便等,及病死犬的肝、脾、肺、腸等組織。本研究使用的其他病毒,如犬瘟熱病毒(CDV)、犬細(xì)小病毒(CPV)、犬副流感病毒(CPIV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、貓傳染性腹膜炎病毒(FIPV)、小鼠肝炎病毒(MHV)等均由本室保存。將待檢組織或糞便樣品加等體積PBS 研磨勻漿,3 000 g 離心15 min,收集上清液待檢。

1.3 核酸抽提及cDNA 模板制備 取100 μL 待檢上清液或血清,加1 mL TRIzol 試劑進(jìn)行RNA 提取;加30 μL DEPC 水溶解RNA 沉淀。取11 μL RNA溶液,加5 倍逆轉(zhuǎn)錄酶濃縮緩沖液4 μL、dNTP 1 μL、隨機(jī)引物1 μL、RNA 酶抑制劑1 μL、AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶2 μL,置PCR 儀上42 ℃反應(yīng)60 min,即得cDNA 模板。取100 μL 上清液或體液樣本用DNA抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行病毒DNA 提取,最后將DNA 用50 μL 水溶解。

1.4 PCR 檢測(cè) 引物針對(duì)CCV 核衣殼蛋白(Nucleocapsid)基因設(shè)計(jì),擴(kuò)增基因片段大小為461 bp,其上游引物(CCVF)序列為:5′-CTA AGA CAA GAG ACA CTA CAC C-3′,下游引物(CCVR)序列為:5′-CTC AAC CTG TGT GTC ATC AAA C-3′。在PCR 薄壁管中,加cDNA 或DNA 模板1 μL、10 倍Taq酶濃縮緩沖液2.5 μL、dNTP 0.5 μL、上下游引物各0.25 μL、Taq 酶0.25 μL,加水補(bǔ)足總體積至25 μL。將PCR管置PCR 儀上,按如下程序擴(kuò)增:首先94 ℃3 min;然后94 ℃15 s,56 ℃15 s,72 ℃30 s,35 個(gè)循環(huán);最后72 ℃3 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后,用凝膠成像系統(tǒng)拍攝。

1.5 熒光RPA 引物和探針設(shè)計(jì) 使用Vector NTI Suite 軟件分析不同國(guó)家和地區(qū)分離的CCV 核蛋白(nucleoprotein)編碼基因的保守序列,用Primer Express 軟件設(shè)計(jì)RPA 引物和探針。實(shí)時(shí)熒光RPA 檢測(cè)的上游引物(RPAY-CCVF)序列為:5′-CTG GAA GAG AAC TGC AGG TAA AGG TGA TGT GAC-3′,下游引物(RPAY-CCVR) 序列為:5′-TCG CCA TCT TCC TTT GCA GTC CAA TAG CTT CC-3′,RPA 探針(RPAY-CCVP)序列為:5′-CAT TAC CCA CAA CTG GCT GAA TGT GTT CCA TCT G(FAM-dt)(THF)(BHQ1-dt)TAG CAT TCT G-C-3′。引物和探針由上海輝睿生物科技有限公司合成。

1.6 實(shí)時(shí)熒光RPA 檢測(cè) 采用GENIE Ⅱ恒溫?cái)U(kuò)增PCR 儀。反應(yīng)體系為:25 μL 2 倍反應(yīng)緩沖液、7.2 μL dNTP、5 μL 10 倍探針酶混合物、上下游引物(RPAYCCVF、RPAY-CCVR)各2.1 μL、10 μmol/L 熒光探針0.6 μL;混勻后,再加入2.5 μL 20 倍核心反應(yīng)液、1 μL 50 倍RT 反應(yīng)液、1 μL 50 倍Exo 反應(yīng)液;混勻后,最后加入2.5 μL 280 mmol/L 醋酸鎂、1 μL待檢核酸溶液。反應(yīng)條件為:39 ℃孵育25 min。反應(yīng)結(jié)束后,查看熒光擴(kuò)增曲線進(jìn)行結(jié)果判定。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)時(shí)熒光RPA 檢測(cè)CCV 的特異性試驗(yàn) 分析CCV 核蛋白基因序列,設(shè)計(jì)引物及探針,建立實(shí)時(shí)熒光RPA 檢測(cè)CCV 方法,并分別使用其他犬病毒(如:CDV、CPV、CPIV)和其他物種的冠狀病毒(如:TGEV、FIPV、MHV)作為對(duì)照,確認(rèn)所建立方法的特異性。結(jié)果顯示,經(jīng)實(shí)時(shí)熒光RPA 檢測(cè),CCV 陽(yáng)性樣品在反應(yīng)7 min 后熒光信號(hào)出現(xiàn)顯著增強(qiáng),其他病毒未檢測(cè)到熒光信號(hào)(見(jiàn)中插彩版圖1)。

圖1 實(shí)時(shí)熒光RPA 檢測(cè)CCV 的特異性

2.2 實(shí)時(shí)熒光RPA 檢測(cè)CCV 的敏感性試驗(yàn) 為測(cè)試建立的實(shí)時(shí)熒光RPA 方法的敏感性,將CCV陽(yáng)性樣品cDNA 進(jìn)行定量并梯度稀釋,制備濃度分別為1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL、1 fg/μL 的模板,再分別用實(shí)時(shí)熒光RPA 和PCR 方法檢測(cè)。結(jié)果顯示,RPA 檢測(cè)CCV cDNA 模板的下限量為100 fg,與之對(duì)應(yīng)PCR檢測(cè)CCV cDNA 模板的下限量為1 pg(見(jiàn)中插彩版圖2 及圖3)。

圖2 實(shí)時(shí)熒光RPA 檢測(cè)CCV 的敏感性

2.3 實(shí)時(shí)熒光RPA 檢測(cè)CCV 感染犬的臨床樣本為了進(jìn)一步驗(yàn)證建立的實(shí)時(shí)熒光RPA 方法的可靠性,將其應(yīng)用于CCV 病死犬的組織器官及血液、尿液和糞便等易于采集的體表樣本以及30 份CCV陰性犬糞便樣本的檢測(cè)。結(jié)果顯示,經(jīng)實(shí)時(shí)熒光RPA 檢測(cè),4 份CCV 病死犬的組織樣品(小腸、肝、肺、脾等)和3 份CCV 感染犬的體表樣本(血液、尿液和糞便)均可檢測(cè)到熒光信號(hào)的顯著擴(kuò)增,而空白對(duì)照和所有CCV 陰性樣品均未檢測(cè)到熒光信號(hào)(見(jiàn)中插彩版圖4);使用傳統(tǒng)的RT-PCR 方法,對(duì)所有臨床樣本進(jìn)行復(fù)檢,其檢測(cè)結(jié)果與實(shí)時(shí)熒光RPA一致,符合率為100%(圖5)。

圖3 RT-PCR 檢測(cè)CCV 的敏感性試

圖4 實(shí)時(shí)熒光RPA 檢測(cè)CCV 陽(yáng)性犬的臨床樣本

圖5 RT-PCR 檢測(cè)CCV 陽(yáng)性犬的臨床樣本

圖6 實(shí)時(shí)熒光RPA 檢測(cè)不同地區(qū)犬中分離到的CCV 陽(yáng)性樣本

2.4 實(shí)時(shí)熒光RPA 檢測(cè)不同地區(qū)犬中分離到的CCV 陽(yáng)性樣本 用建立的實(shí)時(shí)熒光RPA 方法檢測(cè)本室于2007 年至2015 年從口岸入境犬中分離到的6 份CCV 陽(yáng)性樣本,這其中2 份來(lái)自日本入境犬(CCV-JP1、CCV-JP2)、2 份來(lái)自澳大利亞入境犬(CCV-AU1、CCV-AU2)、2 份來(lái)自俄羅斯入境犬(CCV-RU1、CCV-RU2)。結(jié)果顯示,6 份CCV 陽(yáng)性樣本經(jīng)實(shí)時(shí)熒光RPA 檢測(cè)均出現(xiàn)了熒光信號(hào)的顯著擴(kuò)增,而空白對(duì)照未檢測(cè)到熒光信號(hào)(見(jiàn)中插彩版圖6);經(jīng)RT-PCR 復(fù)測(cè),這6 份樣本均擴(kuò)增出了目的大小的基因片段(圖7)。

圖7 RT-PCR 檢測(cè)不同地區(qū)犬中分離到的CCV 陽(yáng)性樣本

3 討論

CCV 屬于套氏病毒目(Nidovirales)、冠狀病毒科(Coronaviridae)、冠狀病毒屬(Coronavirus)I 群病毒,其基因組為不分節(jié)段單正鏈RNA,大小在27～32 kb 之間,是所有RNA 病毒中最大的。CCV 是的一種重要的感染犬的病毒,其發(fā)病率高,通常與多種犬病并發(fā),具有一定的致死性,對(duì)犬養(yǎng)殖業(yè)危害嚴(yán)重,是我國(guó)出入境口岸寵物及野生動(dòng)物檢疫監(jiān)測(cè)的重要對(duì)象。為適應(yīng)口岸對(duì)進(jìn)出境寵物快速檢疫的需要,本研究建立了實(shí)時(shí)熒光RPA 快速檢測(cè)CCV的方法。該方法具有良好的特異性,其與對(duì)照犬病毒(如:CDV、CPV、CPIV)和TGEV、FIPV、MHV 等同屬的冠狀病毒均未出現(xiàn)交叉反應(yīng)。通過(guò)與RT-PCR方法的比對(duì)檢測(cè),證實(shí)本研究建立的實(shí)時(shí)熒光RPA方法的敏感性比傳統(tǒng)RT-PCR 方法高了一個(gè)數(shù)量級(jí)。通過(guò)與RT-PCR 對(duì)比檢測(cè)CCV 臨床組織樣本(如:肝、脾、肺、小腸)、易于采集的體表樣本(如:血液、尿、糞便),以及30 份CCV 陰性樣品,證實(shí)本研究建立的實(shí)時(shí)熒光RPA 方法具有與RT-PCR 一致的穩(wěn)定性和可靠性,未出現(xiàn)陽(yáng)性樣品的漏檢以及陰性樣品的誤檢出;將該方法應(yīng)用于復(fù)檢不同時(shí)期從不同國(guó)家地區(qū)分離到的6 份CCV 陽(yáng)性樣本也均得到了陽(yáng)性結(jié)果。另外,CCV 感染犬糞便的熒光信號(hào)峰值較血液和尿液均高,也更易于采集,是良好的篩查CCV 的樣本。與傳統(tǒng)PCR 方法相比,本研究建立的實(shí)時(shí)熒光RPA 檢測(cè)方法的優(yōu)勢(shì)在于其檢測(cè)周期極短(包括結(jié)果判讀在內(nèi),僅需10 -20 min)、操作簡(jiǎn)單(只需將核酸與檢測(cè)體系混合放于恒溫設(shè)備中即可,RNA 檢測(cè)不需逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程)、檢測(cè)設(shè)備便攜(筆記本大小,一次充電可運(yùn)行12 h)、結(jié)果判定簡(jiǎn)便直觀,特別適合于現(xiàn)場(chǎng)及野外使用。本研究建立的熒光RPA 檢測(cè)CCV 的新方法,不僅可應(yīng)用于出入境口岸寵物及野生動(dòng)物的檢疫,同時(shí)也特別適合野外監(jiān)測(cè)點(diǎn)、犬貓科動(dòng)物繁育場(chǎng)和一線獸醫(yī)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的使用,這對(duì)控制CCV 的傳播,減少特種動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失,以及提升動(dòng)物和公眾的健康都具有重要的意義。