質粒介導多黏菌素耐藥基因mcr的研究進展

劉艷華 綜述，鐘橋石，胡龍華 審校

(南昌大學第二附屬醫院檢驗科，江西省醫學檢驗重點實驗室，江西南昌330006)

多黏菌素(polymyxin/colistin)是屬于窄譜類抗生素的聚陽離子抗菌肽，對大多數革蘭陰性菌有較強較快的殺菌作用，特別是對大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌等細菌有良好的抗菌活性。多黏菌素抗菌機理是其能與革蘭陰性菌細胞膜的磷脂中帶負電荷的類脂A結合，造成細胞外膜通透性改變，導致細菌核酸、氨基酸等重要物質外漏，從而抑制細菌生長或導致細菌死亡[1]。近年來，隨著抗菌藥物的廣泛使用，臨床經常能分離到多重耐藥甚至泛耐藥的菌株。2014年，WHO發布的首份全球細菌耐藥監測報告顯示，2013年全球直接死于耐藥菌感染的人數超過100萬，并預計照此趨勢到2020年全球每年將有1000萬人死于多重耐藥菌感染，死亡人數將超過癌癥，全球學者強調了目前細菌耐藥性的嚴重威脅，警告如不采取進一步措施，無藥可用的“抗生素后時代”即將來臨[2]。近十年中國CHINET監測數據研究表明，革蘭陰性桿菌臨床分離株多重耐藥性嚴重，對臨床常用抗菌藥物耐藥率上升明顯，尤其值得注意的是，近幾年耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌 （Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae，CRE）上升趨勢明顯，2015年CRE檢出率高達8%[3]。Nordmann等研究也表明CRE檢出率顯著升高，且其能在臨床上快速傳播[4，5]。更糟糕的是，攜帶耐碳青霉烯類耐藥基因如KPC-2和NDM-1腸桿菌科細菌的快速增加使臨床治療此類菌感染面臨嚴峻的挑戰[6，7]。對于CRE的嚴重感染，臨床可選用的抗菌藥物非常有限，面對如此嚴重的細菌耐藥性，新抗菌藥物的研發速度遠遠滿足不了臨床的需求，老藥新用受到重視，多黏菌素是目前國際上推薦用于治療多重耐藥革蘭陰性桿菌感染的“最后一道防線”[8-11]。

多黏菌素是20世紀六七十年代用于治療革蘭陰性桿菌所致的全身感染，但因其具有較大的腎毒性和神經毒性而棄用。面對多重耐藥革蘭陰性桿菌感染的廣泛流行，多黏菌素作為最后選擇而被重新用于臨床。過往雖然人類抗感染較少使用多黏菌素，但一些國家在養殖業一直廣泛使用多黏菌素以用于動物疫病的預防和治療。隨著多黏菌素廣泛使用，其耐藥性的報道越來越多。革蘭陰性菌對多黏菌素耐藥機制復雜多樣，分為先天性耐藥和獲得性耐藥，大量研究發現，質粒介導是其耐藥率快速上升的重要原因。

1 質粒介導黏菌素耐藥基因mcr及其各亞型的特點

2015年底我國學者[12]首次報道了從人和動物分離的大腸埃希菌中分離到質粒介導的多黏菌素耐藥基因 mcr-1（mobile colistin resistance，mcr-1），隨后在越來越多的CRE菌株中檢出mcr基因，其極大地增加了感染患者的治療難度，使臨床治療面臨著嚴峻的挑戰。更為值得關注的是，短時間內，不斷有新的mcr基因型別被發現，且其分布菌種較廣，目前多種mcr基因型別被報道（包括mcr-2[13]、mcr-3[14]、mcr-4[15]、mcr-5[16]、mcr-6[17]、mcr-7[18]、mcr-8[19]）。這些耐藥基因的突變率很高，每種類型又可細分為若干亞型，迄今為止，mcr-1和mcr-3被報道的亞型最多，且均達十余種亞型。這種多樣性是細菌適應外界抗生素壓力的結果，可能會導致多黏菌素耐藥水平的增高和傳播能力的增強。

1.1 mcr-1 mcr-1位于IncI2型質粒上，它是存在于質粒上的一段基因，全長1626bp，GC含量49%，該基因上游有一個編碼轉移酶的基因ISApl1，下游有一個hp假設蛋白。mcr-1基因產物是mcr-1蛋白，它屬于磷酸乙醇胺轉移酶家族，mcr-1蛋白降低了多黏菌素與細胞外膜脂多糖上類脂A的親和力，從而導致細菌對多黏菌素不敏感。mcr-1含有5個跨膜的a螺旋并具有2個催化結構域，跨膜結構域可以將催化結構域錨定到細胞質膜的表面，完成對類脂A的共價修飾。到目前為止，已在多個國家的人類和食源動物的多種腸桿菌科細菌中檢測到mcr-1基因，攜帶mcr-1基因的細菌可以很好地適應各種宿主，并在動物和（或）人類之間傳播。mcr-1基因已在腸桿菌科的多個種屬中發現，包括大腸埃希菌、產氣腸桿菌、陰溝腸桿菌、阪崎腸桿菌、宋內志賀菌、布氏檸檬酸桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、克雷伯菌屬和沙門菌屬等細菌，攜帶mcr-1基因的菌株、質粒及其側翼序列都具有很高的多樣性[20]。更為令人擔擾的是，近年來，相繼在世界各地發現 mcr-1.1[21]、mcr-1.2[22]、mcr-1.3[23]、mcr-1.4[24]、mcr-1.5[25]、mcr-1.6[26]、mcr-1.7[24]、mcr-1.8、mcr-1.9[27]、mcr-1.10[17]、mcr-1.11、mcr-1.12 等亞型，目前已經發現了mcr-1各亞型已達10余種 （表)。Perry等[29]研究證實質粒水平轉移已成為mcr基因的主要傳播途徑。從表中可知，Inc X4、Inc 12、Inc H11、IncH12、Inc F、Inc P 等質粒都可攜帶 mcr-1及各亞型，其中 Inc X4和Inc 12質粒是最主要的傳播質粒，攜帶mcr-1及各亞型的菌株最多的是大腸埃希菌，且大多數菌株為多重耐藥細菌。

1.2 mcr-2 Xavier等[13]從豬和牛中分離獲得的的耐多黏菌素大腸埃希菌中發現了一種新的質粒介導的多黏菌素耐藥基因mcr-2，該基因位于IncX4質粒上，與mcr-1的核苷酸和氨基酸序列分別有76.7%和81.0%的同源性。此研究發現mcr-2表達的蛋白具有兩個結構域，其中結構域1（殘基1～229）是一種二級膜轉運蛋白，具有將溶質轉移到膜上的功能，結構域2（殘基230～538）是脂寡糖磷酸乙醇胺轉移酶結構域；該研究系統發育樹分析發現mcr-2可能起源于莫拉菌屬，因mcr-2與脂質磷酸酶基因位于質粒同一遺傳元件IS1595中，該脂質磷酸酶基因與莫拉菌屬的磷酸酶具有高度的同源性。該研究還發現，在比利時，從豬身上分離獲得的多粘菌素耐藥大腸桿菌中mcr-2的流行率遠高于mcr-1，因此，當地衛生行政部門應加強耐多黏菌素革蘭陰性桿菌中mcr-2篩查的分子流行病學監測。Abuoun等[17]在莫拉菌屬還發現了mcr-2.1和mcr-2.2突變亞型，mcr-2.1與來自大腸埃希菌中的mcr-2具有98.5%氨基酸的同源性，僅有8個氨基酸變異；然而mcr-2.2卻有65個氨基酸發生了突變，突變率較高，隨后經Abuoun等研究證實，mcr-2.2(1617 bp)即為 mcr-6。

1.3 mcr-3 mcr-3最早是在我國山東省發現的，Yin等[14]在健康豬糞便分離的大腸埃希菌中發現了可移動質粒介導的耐藥基因mcr-3，該基因與18個額外的耐藥決定簇共存于大小為261119bp IncHI2型質粒中。mcr-3基因全長為1626bp，其與mcr-1和mcr-2的差異較大，其中核苷酸序列與mcr-1和mcr-2只有45.0%和47.0%的同源性，氨基酸序列與mcr-1和mcr-2也只有32.5%和31.7%的相似性。然而，mcr-3氨基酸序列與其他腸桿菌科細菌和10種氣單胞菌屬細菌的磷酸乙醇胺轉移酶的同源性分別為99.8%～100%和75.6%～94.8%。mcr-3蛋白具有兩個結構域，結構域1（殘基1-172）含有5個跨膜β-螺旋，而結構域2（殘基173-541）是包含催化中心的周質結構域。該研究發現的mcr-3與在GenBank數據庫中主要在東南亞和北美發現的腸桿菌科和氣單胞菌中的其他磷酸乙醇胺轉移酶相似，表明移動的耐多粘菌素耐藥基因mcr-3可能已經廣泛傳播。有研究[30]也報道發現4株來自泰國的大腸埃希菌分離株攜帶mcr-3基因，其中3株含為mcr-3.1基因，1株具有編碼單個氨基酸變異的mcr-3.2基因。到目前為止，mcr-3是突變類型復雜（其突變亞型僅次于mcr-1，也已達十余種），涉及菌種較多，傳播范圍較廣的黏菌素耐藥基因。

1.4 mcr-4 Alessandra等[15]首次在意大利豬的盲腸內容物中分離的一種耐多黏菌素鼠傷寒沙門菌R3445中發現了mcr-4基因，該基因位于8749bp的ColE10質粒 （命名為pMCR）上，pMCR編碼RepB復制酶、MobA/L動員蛋白和毒素RelE，并與泛菌屬細菌pPSP_ee2質粒顯示99%的核苷酸同源性。在pMCR中，IS5元件側翼區域（即mcr-4蛋白）與希瓦菌屬中包含的磷酸乙醇胺轉移酶有82.0%～99.0%的氨基酸序列同源性，并且分別與mcr-1，mcr-2和mcr-3具有34.0%，35.0%和49.0%氨基酸序列同源性。此研究中的11個mcr-4陽性菌株ColE10復制酶呈陽性，對多黏菌素顯示MIC≥4mg/L。質粒ColE是具有廣泛宿主范圍的質粒，可在不同菌種之間播散。因此，在歐洲，對來自人類和食用動物的沙門菌和大腸埃希菌，需要立即實施包括新基因mcr-4在內的mcr基因篩選。之后，mcr-4亞型mcr-4.2、mcr-4.3、mcr-4.4等相繼在不同菌株中被發現。

1.5 mcr-5 2017年，有學者[16]在 2011-2016年間分離獲得的414株乙型副傷寒沙門菌的14株mcr-1-、mcr-2-和mcr-3陰性的耐黏菌素d-酒石酸發酵乙型副傷寒沙門菌亞種（Salmonella Paratyphi B dTa+)中，通過全基因組測序發現一種新的與轉座子相關的磷酸乙醇胺轉移酶基因mcr-5，其基因全長1644bp，它是Tn3家族7337bp轉座子的一部分，該基因通常位于多拷貝ColE型質粒上。此外，來自哥倫比亞的大腸埃希菌菌株也顯示攜帶mcr-5基因[15]，mcr-5含有3個結構域，即1個跨膜結構域，1個硫酸酯酶結構域和一個未知功能的結構域 (DUFl705)。 mcr-5 與 mcr-1、mcr-2、mcr-3、mcr-4氨基酸序列差異較大，分別只有36.11%、35.29%、34.72%和33.71%的同源性，mcr-5是由小型多拷貝ColE型質粒攜帶的，與之前發現的型別不同，其不攜帶任何參與質粒接合相關的轉移基因。然而，在mcr-5硫酸酯酶結構域C末端中包含5 個保守殘基 (E248、T286、H389、D458 和 H459)，其與 mcr-1、mcr-2、mcr-3 和 mcr-4 中的殘基相同。迄今為止，mcr-5也已發現有幾種突變亞型。

1.6 mcr-6mcr-6的GenBank登記號為NG-055781，研究發現[17]，它與來自大腸埃希菌的mcr-2顯示87.9%的氨基酸同源性，具有65個氨基酸變異，與來自莫拉菌的mcr-2.1顯示87.8%氨基酸同源性，具有66個氨基酸變異；攜帶mcr-6的莫拉菌屬質粒與攜帶mcr-2的大腸埃希菌質粒具有85.6%同源性，僅有一小部分（86bp）的PAP2基因在大腸埃希菌中被保留；有趣的是，在含有mcr-6的質粒中并沒有找到屬于IS1595系列的插入元件ISEc69。

1.7 mcr-7 Yang等[18]首次從中國小雞分離的3株肺炎克雷伯菌中發現一種新的質粒介導的多黏菌素耐藥基因mcr-7.1，該基因位于大小為65631bp且包含87個開放閱讀框 （ORFs）的IncI2質粒(pSC20141012)上，與mcr-3基因具有70%的氨基酸同源性。推導出的mcr-7.1基因產物的氨基酸序列具有539個氨基酸，為磷酸乙醇胺轉移酶。mcr-7.1 蛋白質序列與 mcr-1，mcr-2，mcr-3，mcr-4，mcr-5和mcr-6的氨基酸同源性分別為35%，34%，70%，45%，36%和33%。mcr-7.1的結構可分為兩個結構域，分別為磷酸乙醇胺轉移酶（硫酸酯酶）（氨基酸231～516）的結構域和跨膜模塊的結構域，其與mcr-3表現出類似的結構。該研究系統發育樹分析顯示mcr-7.1與mcr-3樣序列具有緊密的遺傳關系。值得注意的是，幾乎所有mcr-7.1的mcr-3樣序列都來源于氣單胞菌屬。此外，發現pSC20141012中mcr-7.1上游的ORFs與維氏氣單胞菌中的磷酸二酯酶基因相似。這些發現表明，就像mcr-3一樣，mcr-7.1起源于氣單胞菌屬。

1.8 mcr-8最新研究[19]來自于豬糞的耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌分離株中發現了一種新的移動多黏菌素抗性基因mcr-8，其位于大小為95983bp的Inc-FII型質粒上。此mcr-8氨基酸序列與mcr-1，mcr-2，mcr-3，mcr-4，mcr-5，mcr-6 和 mcr-7 的同源性分別 為 31.08% ，30.26% ，39.96% ，37.85% ，33.51% ，30.43%和37.46%，功能性克隆研究表明，攜帶有mcr-8基因的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌均對多黏菌素耐藥。mcr-8含有兩個結構域，結構域1（殘基1～234）含有5個跨膜α-螺旋，而結構域2（殘基235～565）位于催化中心。該研究顯示，新型mcr-8基因在肺炎克雷伯菌中傳播，更糟糕的是，肺炎克雷伯菌中mcr-8和blaNDM耐藥基因的共存和流行可能通過食物鏈或環境途徑進一步威脅公眾健康。

2 防控策略

抗生素耐藥性被認為是21世紀對人類健康最嚴重的全球性威脅之一，尤以CRE最為顯著[31，32]。在多黏菌素耐藥機制中，除染色體和質粒介導其耐藥外，外排泵系統、莢膜多糖和細胞外膜蛋白OprH過度表達及細菌形成生物膜等均可能造成細菌對多黏菌素耐藥[33]。由于質粒作為可移動DNA相較于染色體DNA更易復制，且能在不同細菌之間水平傳播，故革蘭陰性細菌中編碼磷酸乙醇胺轉移酶的質粒攜帶的mcr基因及其亞型是導致多黏菌素耐藥性的重要機制。迄今為止，八種不同移動的質粒介導的多黏菌素耐藥基因mcr型別分 別 為 mcr-1(1626bp)、mcr-2(1617bp)、mcr-3(1626bp)、mcr-4(1626bp)、mcr-5(1644bp)、mcr-6(1617bp)、mcr-7(1620bp)和 mcr-8(1698bp)及 其 亞型已在GenBank數據庫中登記并注釋。盡管目前大多數菌株對多黏菌素處于低水平耐藥 (2～16ug/ml)，但大量研究結果仍提示mcr基因類型復雜，突變速度較快，且其與其他耐藥基因如blaNDM和blaKPC等共存形成的高度多重耐藥細菌，將極大地威脅全球公共衛生安全，很可能使臨床治療陷入“無藥可用”的境地[34]。因此，迫切需要采取以下策略進行防控[35，36]：①應大規模對人類和食源性動物進行多黏菌素耐藥基因mcr的篩查，以便了解其流行情況和傳播規律，并評價其對人類健康產生的風險。②監管部門應加強監督管理畜牧養殖業抗生素的使用，定期監測，警惕黏菌素耐藥基因的廣泛傳播。③臨床應合理使用抗生素，積極采用多種新型組合療法來治療多重耐藥菌引起的感染，以減少臨床對多黏菌素的使用。

表1 多黏菌素耐藥基因mcr-1各亞型的特征