一種國產(chǎn)血液核酸篩查系統(tǒng)的性能驗(yàn)證

馮娟

(安陽市中心血站，河南 安陽 455000)

血站血液檢測具有自動(dòng)化、標(biāo)準(zhǔn)化等特點(diǎn)與要求，為保障血液檢測質(zhì)量，《血站技術(shù)操作規(guī)程（2015版）》要求實(shí)驗(yàn)室應(yīng)在正式常規(guī)檢測前對所采購的檢測設(shè)備、試劑、質(zhì)控品進(jìn)行性能評價(jià)，以能夠達(dá)到所要求的性能標(biāo)準(zhǔn)。《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則》（ISO15189：2012）中指出實(shí)驗(yàn)室應(yīng)評估工作所選用的方法和程序，確定設(shè)備能夠達(dá)到所要求的性能標(biāo)準(zhǔn)，通過獲取客觀證據(jù)（以性能特征形式）證實(shí)檢驗(yàn)程序的性能與其聲明相符。國內(nèi)學(xué)者對檢測系統(tǒng)的性能評價(jià)多集中于精密度、準(zhǔn)確度、靈敏度、特異性等性能參數(shù)[1]。本研究針對一種國產(chǎn)血液核酸篩查系統(tǒng)進(jìn)行性能驗(yàn)證，以確認(rèn)該檢測系統(tǒng)在本實(shí)驗(yàn)室的適用性。

1 材料與方法

1.1 核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和血清盤 應(yīng)選擇參考血清盤，以保證性能驗(yàn)證結(jié)果的量值溯源。參考血清盤應(yīng)包含具有不同分析物濃度的臨床標(biāo)本。核酸國家二級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（北京康徹思坦生物技術(shù)有限公司）批號：201604001；核酸系列血清評價(jià)盤（北京康徹思坦生物技術(shù)有限公司）批號：201605002、201605003。

1.2 試劑與儀器 主要試劑：乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒（HIV-1）核酸檢測試劑盒 （PCR-熒光法）（上海浩源生物科技有限公司）；主要儀器：ChiTas BSS1200核酸血液篩查系統(tǒng)（上海浩源生物科技有限公司）；ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；BSC-1500ⅡB2-X生物安全柜 (濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)公司)；TDL5B低速冷凍離心機(jī)(長沙英泰儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 一般要求 在性能驗(yàn)證前，應(yīng)選擇國家批準(zhǔn)使用的檢測設(shè)備、試劑。試驗(yàn)開始前，按要求對儀器進(jìn)行安裝、維護(hù)校準(zhǔn)、人員培訓(xùn)，保證設(shè)備在正常狀態(tài)下進(jìn)行。

1.3.2 準(zhǔn)確度驗(yàn)證 核酸定性試驗(yàn)準(zhǔn)確度采用陰、陽性符合率來驗(yàn)證。選取PT血清盤中8例陰性樣本與28例陽性（HBV 11例、HCV 10例、HIV 7例）樣本按照3例陽性、1例陰性模式交替排放，采用混檢和單檢模式進(jìn)行檢測，計(jì)算混檢、單檢模式陰、陽性結(jié)果符合率。陰性符合率=（非反應(yīng)性樣本/陰性樣本）×100%，陽性符合率=（反應(yīng)性樣本/陽性樣本）×100%。

1.3.3 分析靈敏度驗(yàn)證 選取廠家所標(biāo)明檢出限4倍的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用陰性血漿進(jìn)行梯度稀釋后分別進(jìn)行32次單檢，計(jì)算每個(gè)稀釋度的命中率Hi，Hi=Npos/Ntot(Npos指第i稀釋度的陽性結(jié)果數(shù)，Ntot為第i稀釋度的重復(fù)檢測總數(shù))[2]，利用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行probit回歸分析，計(jì)算95%的檢出限及相關(guān)置信區(qū)間。

1.3.4 精密度驗(yàn)證

1.3.4.1 批內(nèi)精密度 將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA 濃 度分別 為 5IU/ml、50IU/ml、250IU/ml樣本在同一批重復(fù)單檢20次，計(jì)算Ct值的標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)，變異系數(shù)=Ct值的標(biāo)準(zhǔn)差/Ct平均值。

1.3.4.2 批間精密度 將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA 濃 度 分 別 為 200IU/ml、1000IU/ml、2000IU/ml樣本連續(xù)單檢 10d，每天 2次，計(jì)算Ct值的標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)，變異系數(shù)=Ct值的標(biāo)準(zhǔn)差/Ct平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0軟件將樣本命中率結(jié)果進(jìn)行probit回歸分析。

2 結(jié)果

2.1 HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA 準(zhǔn)確度驗(yàn)證 選取PT血清盤中8例陰性樣本與28例陽性樣本，采用混檢和單檢模式分別進(jìn)行檢測。8例陰性樣本，HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA 混檢和單檢結(jié)果均為非反應(yīng)性，符合率為100%；28例陽性樣本，不同含量樣本分別進(jìn)行HBV-DNA、HCVRNA、HIV-RNA混檢和單檢，結(jié)果均為反應(yīng)性，符合率為100%。見表1。

2.2 HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA 樣本命中率結(jié)果 選取廠家所標(biāo)明檢出限4倍的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用陰性血漿進(jìn)行梯度稀釋后分別進(jìn)行32次單檢，計(jì)算每個(gè)稀釋度的命中率。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度（IU/ml）為 ：25.2、12.6、6.3、3.2、1.6、0.8 分 別 進(jìn) 行 HBVDNA單檢，命中率 （%）分別為：100.00、100.00、100.00、96.88、53.13、28.13； 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度（IU/ml）為：93.2、46.6、23.3、11.7、5.9、3.0 分 別進(jìn)行 HCVRNA單檢，命中率 （%）分別為，100.00、100.00、100.00、93.75、56.25、15.63； 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度（IU/ml）為：190.4、95.2、47.6、23.8、11.9、6.0 分別進(jìn)行 HIVRNA單檢，命中率 （%）分別為：100.00、100.00、100.00、87.50、40.63、9.38。 見表 2。

2.3 HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA 分析靈敏度驗(yàn)證 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)每個(gè)稀釋度的命中率，利用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行probit回歸分析，計(jì)算95%的檢出限及相關(guān)置信區(qū)間。HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA的 95%的檢出限分別為 3.63IU/ml、12.71IU/ml、25.49IU/ml；95%的 可 信 區(qū) 間 分 別 為[2.51 ～5.42IU/ml]、 [9.82 ～23.38IU/ml]、 [23.65 ～49.29IU/ml]。 見表 3。

2.4 HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA 精密度驗(yàn)證 將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA濃度分別為 5IU/ml、50IU/ml、250IU/ml樣本在同一批實(shí)驗(yàn)重復(fù)單檢 20次，Ct值的標(biāo)準(zhǔn)差為：0.73、0.44、0.73；變異系數(shù)為：2.08%、1.18%、1.93%；將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA 濃度分別為 200IU/ml、1000IU/ml、2000IU/ml樣本連續(xù)單檢 10d， 每天 2 次，Ct值的標(biāo)準(zhǔn)差為：0.62、0.27、0.61；變異系數(shù)為：1.86%、0.83%、1.62%；批內(nèi)和批間精密度變異系數(shù)小于生產(chǎn)商聲明的變異系數(shù)。見表4。

表1 ChiTas BSS1200核酸血液篩查系統(tǒng)HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA準(zhǔn)確度驗(yàn)證結(jié)果

表2 ChiTas BSS1200核酸血液篩查系統(tǒng)HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA樣本命中率結(jié)果

表3 ChiTas BSS1200核酸血液篩查系統(tǒng)HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA分析靈敏度驗(yàn)證結(jié)果

表4 ChiTas BSS1200核酸血液篩查系統(tǒng)HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA精密度驗(yàn)證結(jié)果

3 討論

性能驗(yàn)證，即使用某特定檢測試劑或系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室按照所提供的試劑盒或檢測系統(tǒng)說明書使用時(shí)，能復(fù)現(xiàn)生產(chǎn)廠家所宣稱的檢測性能，是臨床檢驗(yàn)質(zhì)量管理的重要內(nèi)容之一[3]。系統(tǒng)檢測的最低分析物濃度為分析靈敏度或稱檢出限，是評價(jià)分析方法測試性能的重要指標(biāo)。近年來，隱匿性HBV感染（OBI）越來越受到關(guān)注[4]。隱匿性HBV感染是乙型肝炎病毒感染的一種特殊形式，在獻(xiàn)血者中廣泛存在，給血液安全帶來隱患。患者的血清病毒一般保持在較低水平[5]，以至于常規(guī)PCR不易檢出。國外學(xué)者提出HBV DNA檢測下限為10IU/ml[6]，因此高靈敏度及高特異性的診斷方法對隱匿性感染的檢測非常重要[7]，對于我國HBV高流行率的國情[8]，高靈敏度的核酸檢測試劑顯然是符合血液安全要求的。本次試驗(yàn)中，其95%檢測下限的4倍、2倍、1倍濃度的樣本檢出率為100%，無法進(jìn)行probit分析，因?yàn)楫?dāng)稀釋度命中率處于極端水平（＞0.95）時(shí)，應(yīng)增加更低濃度的稀釋水平，避免影響probit模型的吻合質(zhì)量。在增加到0.5倍濃度時(shí)，出現(xiàn)未檢出樣本，通過probit分析能夠在給定的置信度內(nèi)可靠地計(jì)算出被分析物的最低濃度。本次性能驗(yàn)證中檢出限低于試劑說明書標(biāo)定值，分析原因可能為：⑴本試驗(yàn)所用的陽性血漿為國家二級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，試劑廠家采用的是WHO國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，標(biāo)準(zhǔn)性與溯源性有所不同；⑵所選用的樣本數(shù)量不同，本研究每個(gè)濃度有32例樣本，試劑廠家則選用了100例樣本進(jìn)行檢測，不同的樣本數(shù)量也是造成檢出限結(jié)果差異的因素。以上數(shù)據(jù)證明，廠家標(biāo)明的檢出限含量，本試驗(yàn)為100%檢出，符合試驗(yàn)要求。

循環(huán)閾值Ct值與病毒模板起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，因此可用Ct值計(jì)算實(shí)驗(yàn)CV值，進(jìn)行精密度驗(yàn)證。本次實(shí)驗(yàn)中，HBV-DNA、HCVRNA、HIV-RNA批間精密度CV值分別為：1.86%、0.83%、1.62%，小于批內(nèi)精密度CV值：2.08%、1.18%、1.93%，分析原因?yàn)椋孩艠?biāo)準(zhǔn)物質(zhì)病毒含量不一致，不同濃度樣本的精密度存在差異。較低濃度水平樣本測量誤差可能不遵從正態(tài)分布，穩(wěn)定性差，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的精密度。⑵批內(nèi)精密度實(shí)驗(yàn)是在裝機(jī)后進(jìn)行的，設(shè)備尚在磨合期，后期批間精密度實(shí)驗(yàn)時(shí)，設(shè)備運(yùn)行正常，狀態(tài)穩(wěn)定性有所提高。盡管如此，批內(nèi)、批間精密度均低于廠家標(biāo)明的CV值，說明該系統(tǒng)符合實(shí)驗(yàn)要求，檢測結(jié)果具有良好的重復(fù)性。

不同的檢測項(xiàng)目和檢測系統(tǒng)需要選擇不同的方法學(xué)進(jìn)行性能驗(yàn)證。血液核酸篩查系統(tǒng)為定性試驗(yàn)，且使用國家標(biāo)準(zhǔn)方法，臨界值是唯一的醫(yī)學(xué)決定水平[9]，故性能驗(yàn)證主要為分析靈敏度（檢出限）、準(zhǔn)確度、精密度，使用參考血清盤、能力驗(yàn)證樣本結(jié)合常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢測樣本，可以提供更有意義、更可靠的驗(yàn)證結(jié)果。性能驗(yàn)證應(yīng)在滿足法規(guī)和技術(shù)要求的基礎(chǔ)上，注重實(shí)效性，避免不充分或過度驗(yàn)證。此外，性能驗(yàn)證不能一勞永逸，實(shí)驗(yàn)室除在血液檢測方法使用之前對檢測系統(tǒng)進(jìn)行確認(rèn)外，還應(yīng)在一定使用周期內(nèi)再次進(jìn)行性能驗(yàn)證，以便識別使用過程中產(chǎn)生的偏差[10]。性能驗(yàn)證是一項(xiàng)需要持續(xù)開展的質(zhì)量活動(dòng)，保障血液檢測過程監(jiān)控與持續(xù)改進(jìn)。