T-SPOT.TB在肺外結(jié)核診斷中的應(yīng)用價(jià)值研究

徐燁

(宜春市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 宜春 336000)

肺外結(jié)核是指結(jié)核分枝桿菌侵染肺部以外的部位所引起的結(jié)核病。肺外結(jié)核疾病呈現(xiàn)多臟器、多樣性，而且臨床癥狀不典型、不明顯，大多數(shù)肺外結(jié)核來(lái)源于肺結(jié)核，是由結(jié)核分枝桿菌感染肺部后通過(guò)血行播散及淋巴循環(huán)或逆行傳播，或通過(guò)結(jié)核病灶直接蔓延所致。肺外結(jié)核按發(fā)病部位、發(fā)病臟器命名。肺外結(jié)核由于發(fā)病隱匿且標(biāo)本獲取困難、病理表現(xiàn)不典型、細(xì)菌學(xué)陽(yáng)性率低等原因從而使得肺外結(jié)核的早期診斷受到限制。T-SPOT.TB檢測(cè)是y一干擾素釋放試驗(yàn)中的一種，它是以早期分泌靶抗原6和培養(yǎng)濾過(guò)蛋白10為抗原，刺激單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生y一干擾素，然后用酶聯(lián)免疫方法檢測(cè)y一干擾素從而判斷是否有結(jié)核感染的一種技術(shù)[1]。由于其靈敏度特異度較高而成為肺外結(jié)核診斷的一項(xiàng)主要技術(shù)。

本文通過(guò)對(duì)我院近1年收治的臨床考慮肺外結(jié)核患者的T-SPOT.TB、結(jié)核抗體、血沉等相關(guān)檢測(cè)資料進(jìn)行回顧性分析，以評(píng)價(jià)T-SPOT.TB技術(shù)在肺外結(jié)核診斷中的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集宜春市人民醫(yī)院2015年9月至2016年10月收治并確診為肺外結(jié)核患者87例的臨床資料，及50例非結(jié)核疾病患者和50例健康對(duì)照組作為對(duì)照。肺外結(jié)核納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴標(biāo)本活檢的組織病理結(jié)果顯示為結(jié)核性肉芽腫和干酪樣壞死組織。⑵局部膿液涂片或培養(yǎng)提示抗酸桿菌陽(yáng)性。⑶臨床表現(xiàn)、影像學(xué)等支持結(jié)核、排除其他疾病、且診斷性抗結(jié)核有效者。排除標(biāo)準(zhǔn)：肺結(jié)核和結(jié)核病接觸史，使用免疫抑制劑，HIV檢測(cè)陽(yáng)性。

1.2 主要儀器和試劑 CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）；結(jié)核分枝桿菌 T-SPOT（T-SPOT.TB）試劑盒（牛津Immunotec公司）；結(jié)核抗體試劑盒（北京健乃喜生物技術(shù)有限公司）

1.3 方法 收集患者一般臨床資料，對(duì)每個(gè)研究對(duì)象進(jìn)行T-SPOT.TB、ESR、結(jié)核抗體等檢測(cè)。

1.3.1 T-SPOT.TB檢測(cè) 采集6ml肝素抗凝血，混勻，4h內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。分離單個(gè)核細(xì)胞，并制成細(xì)胞濃度2.5×106個(gè)/ml左右的細(xì)胞工作液。取出預(yù)包被活化抗體的板條，每份標(biāo)本分別加4孔，即AIMV（陰性對(duì)照）、抗原 A（ESAT-6）、抗原 B（CFP-10）、陽(yáng)性對(duì)照50μl，然后在4孔中均加入100μl配置好的細(xì)胞工作液。置CO2培養(yǎng)箱 （37℃，5%CO2，保持濕度）溫育16～18h。洗板，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的小鼠抗人IFN-γ單克隆抗體50μl，4～8℃溫育1h。再次用PBS洗板3次，加入顯色底物50μl，室溫暗處溫育8min。取出用蒸餾水沖洗終止反應(yīng)，晾干，顯微鏡下進(jìn)行斑點(diǎn)計(jì)數(shù)，并記錄斑點(diǎn)數(shù)量。

1.3.2 結(jié)果判斷 空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)為0～5個(gè)且（抗原A或抗原B孔的斑點(diǎn)數(shù)）－（空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)）≥6或者空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)為6～10個(gè)且（抗原A或抗原B孔的斑點(diǎn)數(shù)）≥2×（空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)）檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，表明樣本中存在針對(duì)結(jié)核桿菌特異的效應(yīng)T細(xì)胞；如果不符合上述標(biāo)準(zhǔn)且陽(yáng)性對(duì)照孔正常時(shí)（斑點(diǎn)數(shù)不少于20個(gè)）檢測(cè)結(jié)果為陰性。

1.3.3 結(jié)核抗體檢測(cè) 免疫膠體金法。

1.3.4 血沉檢測(cè) 女性＞20mm/h為陽(yáng)性，男性＞15mm/h為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各組樣本率的比較應(yīng)用Pearson χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料 本研究共收集87例肺外結(jié)核、50例非結(jié)核疾病及50例健康對(duì)照者的資料。其中肺外結(jié)核患者組中包括男性61例，女性26例，平均年齡（48.43±18.23）歲，包括結(jié)核性胸膜炎45例、淋巴結(jié)結(jié)核10例、骨關(guān)節(jié)結(jié)核13例、結(jié)核性腹膜炎8例、結(jié)核性腦膜炎6例、結(jié)核性心包炎1例、皮下組織結(jié)核1例及左乳結(jié)核1例；非結(jié)核疾病患者組中，男性28例，女性22例，平均年齡（47.35±14.23）歲；健康對(duì)照組中，男性 25 例，女性25 例，平均年齡（35.18±16.12）歲。 三組的性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 各組T-SPOT.TB檢測(cè)陽(yáng)性率比較 肺外結(jié)核組抗原 A（ESAT-6）和抗原 B（CFP-10）檢測(cè)陽(yáng)性率分別為83.9%和79.3%，均顯著高于健康對(duì)照組和非結(jié)核疾病組。由于患者對(duì)抗原A和抗原B的免疫反應(yīng)性有所不同，將抗原A和抗原B聯(lián)合觀察結(jié)果可顯著提高檢測(cè)的陽(yáng)性率，見(jiàn)表1。

表1 各組T-SPOT.TB檢測(cè)陽(yáng)性率比較

2.3 幾種檢測(cè)項(xiàng)目在肺外結(jié)核中的診斷性能比較T-SPOT.TB的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、診斷準(zhǔn)確率分別為85.0%、88.0%、92.5%、77.1%、86.8%，均顯著高于結(jié)核抗體和血沉檢測(cè)，雖然抗原A、抗原B均有較高的敏感性、特異性及診斷準(zhǔn)確率，但是聯(lián)合抗原A和抗原B檢測(cè)能顯著提高診斷準(zhǔn)確率，見(jiàn)表2。

3 討論

我國(guó)是除印度以外的第二大結(jié)核高負(fù)擔(dān)國(guó)家，估計(jì)每年新發(fā)130萬(wàn)病例，占全球結(jié)核病的14.3%[2]。而有資料顯示全球肺外結(jié)核約占總結(jié)核的 25%-30%，在中國(guó)約為 9.7%-11.8%[3，4]。 由于肺外結(jié)核存在部位不同，臨床表現(xiàn)差異及其復(fù)雜性，故肺外結(jié)核漏診、誤診較為常見(jiàn)，診斷較為困難。傳統(tǒng)的結(jié)核診斷方法有血沉、結(jié)核菌涂片、結(jié)核菌培養(yǎng)及皮膚結(jié)核菌素試驗(yàn)等，其中病原學(xué)診斷即結(jié)核菌涂片及結(jié)核菌培養(yǎng)是結(jié)核診斷的 “金標(biāo)準(zhǔn)”。但是肺外結(jié)核發(fā)病形式不定，多臟器性，臨床特征不典型，獲得細(xì)菌學(xué)依據(jù)困難，有些需要手術(shù)或穿刺活檢才能獲得標(biāo)本，故限制了病原學(xué)診斷在肺外結(jié)核中的應(yīng)用。而且培養(yǎng)法需要2～8周才能獲得結(jié)果，耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)，結(jié)核菌涂片則敏感性太低，通常需要＞5000個(gè)菌/ml才能檢測(cè)到陽(yáng)性結(jié)果[5]。

表2 幾種檢測(cè)項(xiàng)目在肺外結(jié)核中的診斷性能比較

結(jié)核抗體檢測(cè)是以純化的結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁蛋白抗原來(lái)檢測(cè)血清中相應(yīng)的抗體IgG或者IgM。它是已宿主感染結(jié)核分枝桿菌后的體液免疫應(yīng)答為基礎(chǔ)，檢測(cè)血清中結(jié)核分枝桿菌抗原特異性的抗體，操作簡(jiǎn)單、快速、不需要活細(xì)胞是它的優(yōu)點(diǎn)。但是結(jié)核抗體的檢測(cè)敏感度可能與個(gè)人的免疫狀態(tài)有關(guān)，機(jī)體免疫低下時(shí)不能產(chǎn)生抗體則容易造成假陰性，另外如果患者正處窗口期，未產(chǎn)生抗體也容易造成假陰性。又由于抗體交叉反應(yīng)易造成假陽(yáng)性結(jié)果。崔魴的研究中顯示結(jié)核抗體在肺外結(jié)核診斷中的靈敏度和特異度分別為59.5%和72.4%，本研究結(jié)果與之相近[6]。張曉梅等的研究中TB-Ab對(duì)結(jié)核的診斷靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值分別為60.6%、76.5%、76.1%、61.1%[7]。

T-SPOT.TB是一種利用結(jié)核特異性抗體EAST-6和CFP-10刺激單個(gè)核細(xì)胞釋放y一干擾素，然后再用ELISPOT技術(shù)檢測(cè)釋放出的y一干擾素，從而判斷結(jié)核感染的一種方法。該方法靈敏度高，特異性好，被廣泛應(yīng)用于結(jié)核的診斷。本研究中顯示在肺外結(jié)核診斷中T-SPOT.TB敏感度和特異度為85.0%和88.0%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于結(jié)核抗體、血沉等項(xiàng)目。Kim的一項(xiàng)研究中顯示對(duì)于活動(dòng)性肺外結(jié)核，T-SPOT.TB的敏感性為94%，而PPD的敏感度僅為47%[8]。孫瑛等指出T-SPOT.TB檢測(cè)對(duì)免疫正常的成年人活動(dòng)性結(jié)核診斷敏感性為83%～97%[9]。肺外結(jié)核由于其癥狀不典型，病變部位不確定，故細(xì)菌學(xué)標(biāo)本較難獲得，而結(jié)核T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)使用的是靜脈血，不受病變部位影響，因而拓寬了它的應(yīng)用范圍。另一方面，T-SPOT.TB也不受機(jī)體免疫力的影響，萬(wàn)榮等對(duì)35例HIV合并肺結(jié)核患者的研究T-SPOT.TB的敏感度為74.3%，特異度為86.7%，遠(yuǎn)高于PPD試驗(yàn)[10]。曾江等對(duì)87例艾滋病合并菌陰性肺結(jié)核患者的一項(xiàng)研究顯示TSPOT檢測(cè)的靈敏度為85.1%[11]。T-SPOT.TB在各種肺外結(jié)核的診斷中敏感性均較好，如結(jié)核性胸膜炎、腸結(jié)核等[12，13]。 T-SPOT.TB 用于診斷結(jié)核的標(biāo)本并不局限于血液標(biāo)本，結(jié)核抗原特異性T細(xì)胞具有向病變部位集中的特點(diǎn)，所以也可以用支氣管肺泡灌洗液、痰液、胸腹水、腦脊液等等對(duì)結(jié)核特別是肺外結(jié)核進(jìn)行診斷。劉珍瓊等對(duì)32例結(jié)核性胸膜炎患者的胸腔積液做了T-SPOT.TB檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度為93.75%，特異度為96.15%，且均高于外周血T-SPOT檢測(cè)[14]。雖然T-SPOT能夠?qū)Ω鞣N肺外結(jié)核進(jìn)行診斷，如結(jié)核性胸膜炎、結(jié)核性腦膜炎、腎結(jié)核、腸結(jié)核等，但是它不能對(duì)感染部位進(jìn)行定位，需要根據(jù)其他檢查和臨床體征做出綜合判斷，這也是它的局限性所在[15]。

綜上所述，T-SPOT.TB能有效的診斷肺外結(jié)核，且不受病變部位限制，不受機(jī)體免疫力影響，但是由于個(gè)人對(duì)A、B抗原的反應(yīng)性不同，需聯(lián)合檢測(cè)A、B抗原，這樣可以提高診斷準(zhǔn)確度。