CHD-PAH患兒CFHR2、T-bet mRNA、CF6的變化及其意義

楊慧敏

(鄭州大學附屬兒童醫院，河南省兒童醫院，鄭州兒童醫院，心血管內科，河南 鄭州450000)

先天性心臟病（congenital heart disease，CHD）相關的肺動脈高壓（pulmonary artery hypertension，PAH）的發生，能夠增加患者的惡性心血管結局事件的發生風險，導致患者臨床轉歸的惡化[1]。流行病學研究提示，PAH的發病率可達252～363/10萬人左右[2]。

不同的因素或者生物學因子的改變，能夠通過加劇氧化應激反應、促進肺動脈血管內皮的損傷等，促進肺動脈高壓的發生。補體因子H相關蛋白 2 （complement factor H related protein 2，CFHR2）及外周血單核細胞轉錄因子T-bet mRNA的表達，能夠通過對趨化因子富集的影響，抑制補體成分對于肺動脈內皮下平滑肌細胞增殖的促進作用，降低肺動脈的狹窄和肺動脈高壓的形成風險[3]；偶聯因子-6（coupling factor-6 CF6）的表達，能夠促進血管收縮性因子的釋放，增加內皮素等對于平滑肌的痙攣作用，導致血流灌注阻力的增加[4]。為了進一步評估CHD-PAH患兒CFHR2、T-bet mRNA、CF6的變化，從而為臨床上PAH患者的肺動脈高壓病情評估提供參考，本次研究選取我院2014年2月-2017年5月收集的CHD-PAH患兒60例，探討了不同指標與患者肺功能的關系，報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取我院2014年2月-2017年5月收集的CHD-PAH患兒60例 （CHD-PAH組）、CHD未合并PAH患兒70例（CHD組）。CHD-PAH組，患兒年齡 12～54個月，平均 35.2±11.0個月，男34例、女26例；其中室間隔缺損33例、房間隔缺損 27 例；PAH 程度：輕度組（PAH：30～40mmHg）21例、 中度組 （PAH：40～70mmHg）24 例、 重度組（PAH：＞70mmHg）15 例。 CHD 組，患兒年齡 12～60個月，平均 38.0±13.2個月，男39例、女 31例；其中室間隔缺損38例、房間隔缺損32例。兩組患者的年齡、性別、CHD類型比較，差異無統計學意義，具有可比性。納入標準：⑴CHD及PAH的診斷標準參考中華醫學會制定的標準[5]；⑵患者年齡1～5歲；⑶經超聲心動圖、彩色多普勒超聲檢查確診；⑷PAH患兒的肺動脈高壓＞30mmHg；⑸本研究獲得患兒家長的知情同意。排除標準：⑴合并惡性腫瘤；⑵由已知其他病因導致肺動脈高壓；⑶伴有造血系統疾病、免疫系統疾病；⑷近期使用激素類藥物治療。

1.2 指標檢測方法 CFHR2、CF6的檢測：采用化學發光法檢測CFHR2，檢測儀器為MAGLUMI化學發光免疫分析儀及其配套試劑。采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附法檢測CF6，檢測儀器為美國Bio-Bad全自動酶標儀，試劑盒購自南京建成生物工程研究所，嚴格按照試劑盒說明書操作。

T-bet mRNA的檢測：采集血液5ml，加入0.2ml的氯仿，2℃～8℃冰凍離心機中離心(12000g/min，15min)，反復一次洗滌 RNA，棄上清，在管底部可見一乳白色小沉淀物，加入1ml 75%乙醇，0.1%DEPC水溶解。加入HPV基因和GAPDH上下游引物、0.1%DEPC使其終濃度均為20pmol/ul，制備反應體系，RT-PCR擴增的條件與參數：48℃，45min，94℃，2min；94℃ 30s，58℃ 60s，68℃ 2min 共40個循環；循環完畢后68℃延伸7min。

1.3 統計學方法 數據統計分析采用SPSS 16.0軟件，采用（±s）表示計量資料，兩組間比較采用成組設計t檢驗、三組間比較采用單因素方差分析法、手術前后對比采用配對t檢驗；計數資料比較采用χ2檢驗；P值＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患兒的血清CFHR2、CF6及T-bet mRNA水平比較 CHD-PAH患兒的血清CFHR2、T-bet mRNA水平顯著的低于CHD組患兒，差異具有統計學意義（P＜0.05）；CHD-PAH 患兒的 CF6 水平顯著的高于CHD組患兒，差異具有統計學意義（P＜0.05）；見表 1。

表1 兩組患兒的血清CFHR2、CF6及T-bet mRNA水平比較（±s）

表1 兩組患兒的血清CFHR2、CF6及T-bet mRNA水平比較（±s）

組別 n CHD-PAH組CHD組t值P值60 70 CFHR2（μg/L） CF6（ng/L） T-bet mRNA 76.1±22.9 160.3±48.4 12.339＜0.001 242.9±66.0 184.0±43.5 6.084＜0.001 6.93±0.58 7.40±0.62 4.438＜0.001

2.2 不同PAH病情患兒的血清CFHR2、CF6及T-bet mRNA水平比較 輕度、中度CHD-PAH患兒的血清CFHR2、T-bet mRNA水平顯著的高于重度CHD-PAH 組患兒（P＜0.05）；輕度、中度 CHD-PAH患兒的CF6水平顯著的低于重度CHD-PAH組患兒（P＜0.05）；輕度 CHD-PAH 患兒的血清 CFHR2、T-bet mRNA水平顯著的高于中度CHD-PAH組患兒（P＜0.05）；輕度CHD-PAH患兒的CF6水平顯著的低于中度CHD-PAH組患兒 （P＜0.05）；見表2。

表2 不同PAH病情患兒的血清CFHR2、CF6及T-bet mRNA水平比較（±s）

表2 不同PAH病情患兒的血清CFHR2、CF6及T-bet mRNA水平比較（±s）

PAH程度 n輕度中度重度F值P值21 24 15 CFHR2（μg/L） CF6（ng/L） T-bet mRNA 114.8±21.8 73.0±18.4 45.6±17.2 33.092＜0.001 194.2±61.4 238.8±55.0 311.2±59.1 29.817＜0.001 7.31±0.55 6.94±0.53 6.40±0.47 13.372＜0.001

2.3 CHD-PAH患兒手術前后的血清CFHR2、CF6及T-bet mRNA水平比較 手術后1周，CHDPAH患兒的血清CFHR2、T-bet mRNA水平顯著的較術前升高（P＜0.05）；CF6水平較手術前顯著的降低（P＜0.05）；見表 3。

表3 CHD-PAH患兒手術前后的血清CFHR2、CF6及T-bet mRNA水平比較（±s）

表3 CHD-PAH患兒手術前后的血清CFHR2、CF6及T-bet mRNA水平比較（±s）

時間 n手術前手術后1周t值P值CFHR2（μg/L） CF6（ng/L） T-bet mRNA 76.1±22.9 121.6±34.0 8.598＜0.001 242.9±66.0 193.0±31.8 5.276＜0.001 6.93±0.58 7.32±0.44 4.150＜0.001

2.4 CFHR2、CF6及 T-bet mRNA的診斷學分析血清CFHR2、CF6及T-bet mRNA水平鑒別診斷CHD-PAH患兒與CHD患兒的ROC曲線下面積AUC 值分別為 0.837、0.747、0.706。 見圖 1。

圖 1血清 CFHR2、CF6及 T-bet mRNA水平鑒別診斷CHD-PAH患兒與CHD患兒的ROC曲線

3 討論

先天性心臟病血流動力學和心臟血管的結構的改變等均能夠促進PAH的發生，甚至導致患者多器官功能衰竭的發生[6，7]。長期的臨床回顧性分析研究顯示，現階段臨床上PAH患者的治療總體有效率、治療后的再次入院率等指標仍然較高，遠期的心力衰竭的發生率仍然超過15%[8，9]。同時臨床上缺乏對于PAH患者肺功能評估的指標，雖然動脈血氣分析能夠為肺動脈高壓的病情評估提供參考，但其屬于有創檢查，且費用較高。本次研究對于CFHR2、CF6及T-bet mRNA等指標的相關研究，不僅能夠為PAH患者的生物學治療提供潛在的治療靶點，同時還能夠為PAH患者的肺動脈高壓的病情評估提供血清學參考。

CFHR2對于補體成分的調控作用，能夠抑制下游C4、C3成分的激活，減輕其對于患者肺動脈血管內皮細胞的損傷，抑制內皮細胞的凋亡。近年來基礎領域的研究提示，CFHR2能夠抑制單核細胞對于動脈血管內皮的浸潤，降低血管內皮持續性病變的風險；T-bet mRNA作為核因子轉錄的重要調控因素，其能夠通過抑制肺動脈內皮細胞核轉錄上游啟動子的激活，減少血管內皮下組織的纖維化改變。T-bet mRNA還能夠通過穩定MAPK信號通路，降低MAPK激活導致的動脈管壁的重塑性改變[10，11]；CF6能夠誘導內皮素的分泌，降低一氧化氮的合成和釋放，導致動脈的持續性痙攣，增加動脈血的血流動力學指標的紊亂，促進肺動脈高壓的發生[12]。部分研究揭示了CFHR2、T-bet mRNA、CF6在PAH患者中的差異性表達情況，認為CFHR2等的下降是促進PAH發生的重要因素，但缺乏對于不同指標與肺動脈高壓程度的關系分析。

本次研究對于血清中不同指標的分析可見，CFHR2、T-bet mRNA、CF6在 PAH 患者中均存在明顯的異常表達波動，其中CFHR2、T-bet mRNA的表達濃度明顯下降，而CF6的表達濃度明顯上升，提示了 CFHR2、T-bet mRNA、CF6 等均影響到了PAH患者肺動脈高壓的病情進展。從原因上分析，相關指標對于患者肺動脈高壓的影響主要包括下列幾個方面[3，13]：⑴CFHR2、T-bet mRNA 的上升能夠抑制肺動脈平滑肌間質細胞的纖維化和脂肪化；⑵CF6的上升能夠影響肺動脈血管內皮細胞的功能，導致局部血流呈現出明顯的“高阻力、低灌注”的現象。張茜等[14]研究者發現肺動脈高壓患者血清中的異常表達情況，CFHR2的表達濃度可平均下降25%以上，同時患者的肺動脈高壓越為嚴重，CFHR2的表達濃度下降越為明顯。在肺動脈病情越為嚴重的患者中，CFHR2、T-bet mRNA的下降程度越高，而CF6的上升幅度越為明顯，這些均提示了 CFHR2、T-bet mRNA、CF6與患者肺動脈高壓的直接關系，CFHR2等能夠通過抑制肺動脈血管的重塑，穩定動脈血壓，從而降低肺動脈血壓的波動程度[15]。但部分學者并不認為CFHR2等的表達與PAH患者的肺動脈高壓具有線性的關系，不同研究間存在不同的結論，考慮主要由于不同指標的監測時機、不同PAH的肺動脈高壓評估方式的差別有關。最后本次研究發現在治療后的患者中，相關指標的表達呈現出了進一步的波動，其中治療后的CFHR2、T-bet mRNA有所恢復，而CF顯著下降，進一步提示了CFHR2、T-bet mRNA、CF6等指標與PAH患者的病情關系。診斷學分析研究可見，CFHR2、CF6及T-bet mRNA在單獨診斷肺動脈高于的過程中均具有一定的價值，其中CFHR2單獨診斷的AUC下曲線面積較大，提示了CFHR2在單獨診斷疾病的過程中具有較高的參考價值。

綜上所述，CHD-PAH患兒血清CFHR2、CF6及T-bet mRNA較單純CHD患兒發生顯著的改變，并且與肺動脈高壓嚴重程度具有一定的關系。