動脈粥樣硬化患者外周血單個核細胞ABCA1基因表達及其臨床意義

莫燕芳，王洋洋，梁潔玲，李海珠，陳立強

(肇慶市第一人民醫院檢驗科，廣東 肇慶 526000)

動脈粥樣硬化主要是由于體內膽固醇水平上升并造成在巨噬細胞內堆積，產生慢性持續性炎癥反應并且在血管內壁沉積而導致血管硬化的疾病[1]。 研究表明ATP結合轉運體 （ATP－bidnding cassette tiansporters，ABC transporters，ABC 轉 運體）參與了巨噬細胞的膽固醇逆向轉運機制，將巨噬細胞和泡沫細胞內的膽固醇轉移至血液或高密度脂蛋白中，經循環系統轉運至肝臟進行分解代謝而抑制巨噬細胞泡沫化。膽固醇在單核細胞內聚集并使單核細胞泡沫化[2，3]。因此，ABCA1可能在AS的發生與發展過程中發揮著很關鍵的作用。為探討ABCA1在巨噬細胞膽固醇流出到血液或轉移到HDL機制中的作用，本實驗采用半定量逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測ABCA1基因在AS患者中的表達與變化，進一步了解其在AS發病機制中所發揮的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取肇慶市第一人民醫院2016年01月至2017年6月確診為AS患者50例，作為AS組，該組患者均滿足中國心臟病委員會對AS的診斷標準，其中男27例，女23例；年齡（55.4±7.2）歲；同期選取45例健康體檢者作為對照組，對照組患者均冠脈造影正常，無冠心病和AS的相關臨床癥狀，血清肌鈣蛋白 （cTnI）無升高（＜0.1ng/ml）。 其中男 28 例，女 17 例；年齡（53.9±6.5）歲。

1.2 儀器與試劑 RNA提取試劑盒（invitrogen）、人單個核細胞分離液 （深圳市達科為生物工程有限公司）、逆轉錄試劑盒（中山大學達安基因公司）、PCR分析儀（ABI 7500）、PCR引物（上海生物工程股份有限公司）等。

1.3 方法

1.3.1 標本采集及單個核細胞分離 無菌操作采靜脈血 2ml，用 EDTA·K2（或者枸櫞酸鈉）抗凝，使用密度梯度沉降法分離單個核細胞，用等體積的0.9%的生理鹽水稀釋全血，在離心管中加入一定體積的分離液，將稀釋后的血樣平鋪到分離液上方，保持兩界面清晰。分離液、全血、生理鹽水的體積為 1：1：1；626×g，離心 20min（水平離心），吸取白細胞層（從上而下的第二層），-80℃冰凍保存。

1.3.2 制備單個核細胞總的RNA 取制備好的勻漿單個核細胞室溫解凍，加入0.25ml氯仿，劇烈震動 20s， 室溫靜置 3min；4℃、12000×g 離心 15min，移上層液體至新EP管，加0.5ml異丙醇，充分震蕩混勻后室溫靜置 15min；4℃、12000×g離心 10min棄上清液，保留底部沉淀；加入無水乙醇0.5ml洗滌沉淀，4℃、7500×g離心 5min，棄上清液，再重復洗滌沉淀一次，56℃干燥5min；加入20μl去離子水溶解RNA，60℃、孵育10min。紫外分光光度儀檢測提取的RNA濃度，-80℃下冰凍保存。

1.3.3 引物的來源 根據在Pubmed中查到ABCA1基因的GenBank序列，同時遵循引物設計原則設計反應的引物，由上海生物工程公司合成，見表1。

表1 引物的設計

1.3.4 RT-PCR檢測ABCA1 mRNA表達 以RNA為模板，使用中山大學達安基因公司RT-PCR反應試劑盒進行RT-PCR反應。擴增條件為50℃30min，94℃ 2min， 然 后 94℃ 30s，56℃ 30s，72℃2min，30個循環。RT-PCR擴增完成后取3μl RTPCR產物在1%瓊脂糖凝膠中進行電泳，恒壓80V電泳30min，紫外透射儀下觀看結果并拍照，圖片經圖像分析軟件Band Scan進行光密度值掃描與分析，根據分析結果計算出各泳道ABCA1與內參照β-actin光密度之比作為ABCA1相對含量值。

1.4 統計學方法 采用SPSS 15.0統計軟件進行分析。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 外周血單個核細胞ABCA1 mRNA的表達 AS患者PBMC中mRNA表達顯著高于對照組 （P＜0.05），差異有統計學意義。見表2、圖1。

表2 PBMC ABCA1 mRNA表達檢測結果（±s）

表2 PBMC ABCA1 mRNA表達檢測結果（±s）

檢測項目 AS 健康對照組ABCA1/β-actin（mRNA） 0.425±0.086 0.253±0.024

圖1外周血單個核細胞ABCA1基因表達

3 討論

血液中膽固醇水平增高，進而在單核細胞內積累并泡沫化是導致動脈粥樣硬化和血管炎癥的重要原因[4]。細胞內膽固醇流出是控制泡沫細胞形成的重要機制，而ABC轉運體在該機制的正常運行中發揮關鍵作用[5，6]。膽固醇從細胞中流出，可轉運至HDL和ApoA1進入血循環至肝臟進行代謝，預防動脈粥樣硬化的發生。對實驗小鼠ABCA1基因進行敲除和實施高脂喂養，基因敲除小鼠均發生動脈粥樣硬化，而且硬化斑塊面積更大且浸潤損傷更嚴重[7，8]。本研究采用RT-PCR比較AS患者和健康者單個核細胞中ABCA1 mRNA水平的差異，發現AS患者ABCA1 mRNA基因表達明顯升高，表明ABCA1可能參與了AS發病機制，是AS潛在的預防或治療靶點[9，10]，綜上所述，深入研究膽固醇轉運體ABCA1基因表達會對As的早期診斷與治療提供依據，對As的疾病監測提供依據。