前列腺癌組織中miR-34b、Cyclin D1 mRNA表達變化及其意義

邱忠凱，譚淼，梁偉，丁全明，滿曉軍

(1本溪市中心醫院，遼寧本溪 117000；2中國醫科大學附屬第一醫院)

近年來，我國前列腺癌(PCa)發病率和病死率有逐漸增高的趨勢，2015年我國男性PCa的發病率為6.03/1萬例，病死率為2.66/1萬例[1]，嚴重危害我國男性尤其是老年男性健康。晚期轉移性PCa及去勢抵抗PCa病死率較高，因而有必要進一步研究PCa的病因及發生發展機制[2]。miRNA-34家族是不同物種間高度保守的家族，該家族成員包括miR-34a、miR-34b、miR-34c，miR-34a位于染色體1p36，而miR-34b和miR-34c位于11號染色體長臂2區3帶(11q23)。研究[3]表明，miR-34家族可通過調節B細胞淋巴瘤(Bcl-2)、c-Met等下游靶基因的表達，發揮抑制腫瘤細胞的作用。miR-34b和miR-34c為同源基因，但因靶基因的不同而發揮不同的調節作用，miR-34b在腫瘤發生發展中的具體作用還有待進一步研究[4]。D型細胞周期蛋白家族由細胞周期蛋白(Cyclin)D1、D2、D3三種蛋白組成，具有調節增殖細胞的G1/S期轉變的作用。Cyclin D1過度表達主要與人類腫瘤發生和細胞轉移有關，其異常表達在PCa、甲狀旁腺腺瘤、乳腺癌、結腸癌、淋巴瘤、黑色素瘤等多種腫瘤發生發展中起關鍵作用。體外細胞實驗中，Cyclin D1的過表達使進入S期的人前列腺癌細胞(LNCaP)數量增多，增加了腫瘤細胞集落形成和腫瘤生長速率[5]。目前，Cyclin D1、miR-34b在PCa中的調控機制及二者之間的關系尚不清楚，需進一步深入研究。本研究通過檢測PCA組織中miR-34b、Cyclin D1 mRNA，分析兩者間及與PCA臨床病理特征的關系，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2012年1月～2015 年1月本溪市中心醫院收治的PCa患者57例，年齡56～79(67.54±7.80)歲，其中≤65歲24例、>65歲33例。所有患者為初次診斷，未接受其他治療，并排除其他惡性腫瘤。參照《中國泌尿外科疾病診斷治療指南》推薦的標準[6]，其中Gleason評分≤6分25例、≥7分32例。臨床分期參照美國癌癥聯合會(AJCC)PCa TNM分期系統[7]，其中Ⅰ～Ⅱ期 26例、Ⅲ～Ⅳ期31例。初始血清PSA≤10 ng/mL 9例，10～20 ng/mL 27例，>20 ng/mL 21例。所有患者術前均檢測血堿性磷酸酶、X線、MRI、核素骨掃描等檢查以明確有無遠處轉移，其中有轉移15例、無轉移42例。PCa組患者術后隨訪時間3～36個月，平均隨訪33.4個月，以門診或電子通訊方式，定期直腸指檢、血清總PSA、B超及MRI等檢查，隨訪至隨訪時間結束或患者死亡，隨訪截止時間2018年1月1日。另選43例BPH患者作對照，年齡57～79(69.57±6.92)歲。手術切取PCa組織及癌旁正常的前列腺組織各57例份(46例標本行PCa根治術獲得，11例行經尿道腫瘤電切獲得)及BPH組織43例份(行恥骨上前列腺摘除術獲得)。本研究經本院醫學倫理委員會批準通過，所有患者知情同意并簽字。

1.2 組織中miR-34b、Cyclin D1 mRNA檢測方法 采用RT-PCR法。將剛離體的PCa組織、癌旁組織及BPH組織置于液氮速凍，后轉運至-80 ℃冰箱保存。細胞中總RNA應用TRIzol法提取。以3 μL總RNA為模板，用TaqMan逆轉錄試劑盒(ABI)進行逆轉錄合成cDNA，反應條件如下：16 ℃、30 min，42 ℃、30 min，85 ℃、5 min。miR-34b：5′-TTTTTATTTGTTTTGTTTTGTGTTTGTTTTG-3′，5′-CAACTACAACTCCCAAACAATCC-3′；內參基因U6：5′-

GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，3′-CGCTTCACG-

AATTTGCGTGTCAT-5′；Cyclin D1：5′-GATACCAGAAGGGAAAGC-3′，5′-ATGCCTAGAACCCCACTA-3′。RT-PCR總反應體系為20 μL，其中含1 μL cDNA，1 μL引物，8 μL Power SYBR Green Master Mix試劑、去離子純水。反應條件為：95 ℃、3 min，95 ℃、30 s，60 ℃、30 s，40個循環。所有反應均在ABI7500 PCR儀上完成，每個樣本重復3次。miRNA-34b及Cyclin D1反轉錄引物、PCR引物、探針、Power SYBR Green Master Mix試劑及ABI7500 RT-PCR儀均購自ABI生物公司。以2-ΔΔCt代表目的基因的相對表達量，計算公式為ΔCt=Ct目的基因-CtU6，ΔΔCt=ΔCt癌組織-ΔCt癌旁組織。

2 結果

2.1 PCa和BPH組織中miR-34b、Cyclin D1 mRNA表達比較 PCa和BPH組織中miR-34b mRNA相對表達量分別為0.57±0.35、1.24±0.48，Cyclin D1 mRNA相對表達量分別為2.72±0.47、0.94±0.21，兩組比較，P均<0.05。

2.2 miR-34b、Cyclin D1表達與PCa臨床病理特征的關系 結果見表1。

2.3 PCa組織中miR-34b與Cyclin D1表達的相關性 PCa組織中miR-34b與Cyclin D1表達呈負相關(r=-0.517，P=0.013)。

表1 miR-34b、Cyclin D1表達與PCa患者臨床病理特征的關系

注：由表1可知，miR-34b、Cyclin D1表達均與Pca患者Gleason評分、TNM分期有關(P均<0.05)。

2.4 組織中不同miR-34b、Cyclin D1表達患者3年總體生存率(OS)比較 所有PCa組織中miR-34b mRNA相對表達量以中位數(P50)0.562為臨界值，分為miR-34b高表達組24例，miR-34b低表達組33例；Cyclin D1 mRNA相對表達量以中位數(P50)2.705為臨界值，分為Cyclin D1高表達組31例和低Cyclin D1表達組26例。miR-34b高表達組、miR-34b低表達組3年OS分別為83.3%(20/24)、72.7%(24/33)，Cyclin D1高表達組、Cyclin D1低表達組3年OS分別為70.9%(22/31)、84.6%(22/26)，兩組比較，P均<0.05。

3 討論

PCa是泌尿生殖系統常見的惡性腫瘤，近年來隨著人口老齡化及飲食結構的改變，其發病率有逐漸升高的趨勢，嚴重威脅男性健康。目前，PCa的治療包括手術、內分泌治療及化療等，但復發和轉移性PCa患者的生存率較低。因此，深入研究其發生發展的機制具有重要意義。

miRNA是非編碼的單鏈RNA分子，可通過與目的基因的mRNA的3′-非翻譯區結合，形成RNA誘導的沉默復合物，影響mRNA的穩定性影響翻譯過程。在許多腫瘤如乳腺癌、肝癌等腫瘤均存在多種miRNA異常表達現象，參與腫瘤增殖、凋亡、分化等病理生理學過程，因此研究其表達有助于腫瘤的診斷、治療方式選擇及判斷預后[8]。miR-34基因位于23號染色體，在乳腺癌、非小細胞肺癌、肝細胞癌等多種腫瘤中均表達下調，下調機制與基因啟動子區甲基化有關[9]。本研究顯示，PCa組織中miR-34b表達下調，此結果與以往研究[10]結果一致，機制可能與miR-34b基因位點11q23雜合性缺失有關，也可能與表觀遺傳學修飾后基因失活有關[11]。本研究還顯示，miR-34b表達與PCa病理分級、分期有關，機制可能與p53蛋白對miR-34表達的調節作用有關，p53基因突變及缺失多發生于高級別、進展期PCa中[12]，p53基因異常表達引起miR-34表達下調，進而miR-34下游靶基因如Bcl-2、c-Met及Sox-2等功能改變，最終導致腫瘤細胞的增殖、浸潤及轉移，而在低分期，低級別PCa中miR-34表達下降不明顯。此外，miR-34b高表達組患者3年總體生存較高，結果表明高表達miR-34b組患者預后較好，可能與miR-34b的抑癌作用有關。

在人類許多腫瘤均發現細胞周期蛋白D基因擴增以及其編碼的蛋白質的過表達的現象，細胞周期蛋白表達或細胞周期蛋白激酶(CDK)活化的失調會導致腫瘤的生物學特征的改變。Cyclin D1位于11q13，作為重要的周期素家族成員，參與G1/S期轉換調節過程。本研究顯示，PCa組織中Cyclin D1表達上調，其機制可能與Cyclin D1原癌基因拷貝數目擴增、基因突變有關。體外實驗研究表明，沉默Cyclin D1基因表達能抑制PCa細胞的增殖[13]，而Cyclin D1過表達促進雄激素依賴性PCa細胞的增殖[14]。本研究還顯示，Cyclin D1表達與Pca病理分級、分期有關，機制可能是D型細胞周期蛋白(D1、D2和D3)的轉錄、翻譯和蛋白質降解受生長因子激活和整合素衍生的黏附信號傳導影響，Cyclin D1高表達會增加腫瘤細胞的侵襲性和轉移性，所以增殖、分化和黏附信號與細胞周期進程相統一的過程[15]。Cyclin D1在腫瘤細胞的侵襲、遷移過程中發揮重要作用，體外實驗中Cyclin D1高表達可提高PCa細胞的侵襲、遷移和轉移能力[16]。此外，Cyclin D1高表達組患者3年OS較低，表明高Cyclin D1表達患者預后不良，可能與高表達組患者分期、分級較高有關。

多種miRNA如miR-195、MiR-218等能夠調節腫瘤細胞中Cyclin D1基因表達，進而影響腫瘤細胞增殖、侵襲轉移及凋亡[17]。本研究顯示，PCa組織中miR-34b mRNA與Cyclin D1 mRNA表達呈負相關，與結果與以往對miR34研究結果一致，其相互作用的機制可能是miR-34能與Cyclin D1和E2、CDK4和6以及其他調節細胞周期基因的mRNA相互作用，調控細胞增殖過程，當miR-34b表達降低時，腫瘤細胞倍增時間縮短，增殖加快。

總之，PCa組織中miR-34b及Cyclin D1 mRNA均存在異常表達現象，與PCa的發生發展有關，有希望成為PCa診斷、治療及評估預后的新的生物學標志。