海南山蘭米酒酒曲微生物多樣性分析*

楊春敏 黃建初 查麗艷

1（廣州工商學院，廣東廣州 510850）2（華南農業大學，廣東廣州 510642）

山蘭米酒是海南黎族人民配制的一種甜米酒，是海南五指山地區最受歡迎的傳統酒精飲料。山蘭米酒以山蘭稻釀造而成，山蘭稻是一種生長在山坡上的旱稻，有山蘭紅米、山蘭黑米和山蘭糯米3種，釀制山蘭米酒主要以糯米為原料。由于山蘭米酒在糖化發酵期間以糖化過程為主，其酒精度不高，味道甘醇甜美，酒漿黏稠，乳白色中微微泛黃，入口很有質感。

甜酒曲是釀造甜米酒的糖化發酵劑，其所含微生物種類十分豐富，組成復雜，微生物間的相互作用使釀造的米酒口感獨特，香氣濃郁。目前海南山蘭米酒多為手工作坊釀制，采用傳統制作工藝，微生物種類繁多且不穩定，生產控制主要依靠實踐經驗，溫度、用曲量等控制不好，容易產生苦味，導致不同季節不同批次的米酒質量不穩定，因此研究酒曲中微生物種類、數量、代謝作用及微生物間的相互作用就顯得極其重要。大量研究發現酒曲中主要有三大類微生物，即霉菌、酵母菌和細菌。高通量測序技術是目前研究微生物多樣性中應用最廣泛的測序技術，不僅能夠快速地分析復雜微生物群落多樣性，還能檢測到低存在率以及不可培養的微生物，該技術已經廣泛應用于發酵豆豉、醋、米酒、腸道微生物、酸奶等生物群落結構研究。

目前關于山蘭米酒的研究主要集中在釀造工藝優化及營養成分分析等方面，對其微生物群落多樣性研究相對較少。本研究以采集自海南6 個山蘭米酒酒廠的酒曲為研究對象，采用IluminaMiseq 高通量測序平臺對細菌的16SrDNA 和真菌ITS 區域進行測序，分析海南山蘭米酒酒曲的微生物群落多樣性，明確優勢菌群，為更好地提高山蘭米酒品質，推動其產業發展，建立現代化釀酒新工藝提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海南山蘭米酒酒曲樣品：由編號為A、B、C、D、E、F 的6 個酒廠提供。

QIAGEN DNA Mini-Kit，購于德國QIAGEN 公司；其他化學試劑，均購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

5810R 高速冷凍離心機，德國Eppendorf；C1000 型PCR 儀，美國BIO-RAD 公司；電泳儀、電泳槽，北京市六一儀器廠；Gel Doc 型凝膠成像儀，美國BIO-RAD 公司；Miseq 高通量測序儀，美國Ilumina 公司；Agilent 2100 生物分析儀，美國安捷倫公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品總DNA 的提取

將酒曲用研缽粉碎，使用QIAGEN DNA Mini-Kit 試劑盒提取各酒曲樣品中所有微生物的總DNA，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測無明顯降解，質量合格。DNA 樣品于-20 ℃保存，備用。

1.3.2 PCR 擴增

以1.3.1 得到的總DNA 為模板，對細菌16S rDNA 的V3-V4 區和真菌的ITS 區進行PCR 擴增，具體引物見表1。

表1 細菌、真菌的PCR 擴增引物

1.3.3 PCR 產物的定量、混樣及測序

按操作說明使用The Agilent DNA1000Kit 和Agilent2100 生物分析儀對PCR 擴增產物精確定量。將所有樣品的擴增產物等濃度混勻至終濃度為100 nmol/L，于IluminaMiseq 高通量測序平臺上機分別對樣品中的細菌和真菌序列測序。

2 結果與分析

2.1 不同酒廠酒曲樣品的Alpha 多樣性分析

采用Alpha 多樣性指標的Simpson、Shannon、Chao1 和ACE 指數，對采集自6 個不同酒廠的酒曲樣品中細菌和真菌的Alpha 多樣性進行了比較分析，結果如圖1 所示。

圖1 不同酒廠酒曲樣品的Alpha 多樣性比較分析

由圖1 可知，從6 個酒廠收集的酒曲樣品中，酒廠E 的酒曲樣品中細菌群落的Alpha 多樣性最高，Simpson、Shannon、Chao1 和ACE 指數都高于其他5 個酒廠，說明其細菌群落的物種豐富度及均勻度都較高。酒廠C 的酒曲樣品中真菌的Chao1 以及ACE 指數均明顯高于其余5 個酒廠（圖1GH），說明其酒曲樣品中真菌物種豐富度較高；而其細菌的Chao1 以及ACE 指數卻比較小（圖1EF），說明酒曲樣品中細菌物種豐富度較低。這些結果表明，不同酒廠收集到的酒曲真菌和細菌Alpha 多樣性存在差異。

2.2 不同酒廠酒曲樣品的優勢微生物組成及其相關性

通過對各酒曲樣品中的主要微生物進行定量分析發現，細菌菌屬中片球菌（Pediococcus）（39.20%）、腸桿菌屬（Enterobacter）（16.06%）、魏斯氏菌Weissella（8.83%）、Klebsiella（5.04%）、Escherichia-Shigella（3.64%）、Pelomonas（1.65%）、坂崎腸桿菌Cronobacter（1.53%）、Ochrobactrum（1.35%）和Ralstonia（1.04%）的含量都超過了1%（圖2A），因此，將這些定義為核心微生物群。其中，片球菌（Pediococcus）數量最多，為39.2%。在真菌層面上，含量從高到低位列前十位的分別是：根霉（Rhizopus）、假絲酵母屬（Candida）、Bullera、Simplicillium、曲霉屬（Aspergillus）、Gibberella、Phaeoacremonium、Archae orhizomyces、Acremonium 和Chaetomium，其中根霉（Rhizopus）為樣品中的絕對優勢菌屬，相對含量大于35%（圖2C）。同時，基于Spearman 等級相關系數，對酒曲樣品中細菌及真菌的優勢菌屬進行了相關性分析，在細菌層面上，片球菌（Pediococcus）與其他菌屬之間呈現負相關，Enterobacter 與Klebsiella 呈明顯正相關（圖2B），在真菌層面上，Bullera 與假絲酵母屬（Candida）正相關性較強，與Gibberella 則呈明顯負相關（圖2D）。

圖2 酒曲樣品中優勢微生物組成

2.3 不同酒廠酒曲樣品的Beta 多樣性分析

采用基于UnweightedUnifrac Distance 和Weighted Unifrac Distance 的PCoA 分析圖譜分別對酒曲樣品進行了細菌和真菌層面上的Beta 多樣性分析，如下頁圖3 所示。代表酒廠B 和C 細菌群落的點均能較好的與其他酒廠區分開，結合表2 可知，酒廠B和C 的細菌群落結構與酒廠D、E、F 均有顯著差異，p＜0.000 1，而酒廠A、D、E、F 的細菌群落混雜程度較高，差異不顯著。從真菌層面來看，酒曲樣品中真菌的群落結構差異小于細菌，各樣品點的混雜程度較高，結合表3，酒廠A 的真菌群落結構與B 和D 差異顯著。

表2 不同酒廠的酒曲樣品基于Unweight UniFrac PC1 及Weight UniFrac PC1 的P 值（細菌）

表3 不同酒廠的酒曲樣品基于Unweight UniFrac PC1 及Weight UniFrac PC1 的P 值（真菌）

2.4 細化差異性菌屬

為進一步研究不同酒廠的酒曲樣品在屬水平上的差異性，選取了p＜0.05 的菌屬作熱圖（圖4）。在細菌層面上，酒廠B 和C 酒曲樣品中Weissella、Bacillis 及Pantoea 含量明顯高于其他組，而Cronobacter、Enterobacter、Klebsiella 及Escherichia-Shigella 含量明顯低于其他組。同時發現6 個酒廠的酒曲樣品中Pediococcus 含量都特別高。在真菌層面上，酒廠E 的Wicherhamomyces 及Candida 含量明顯高于其他組，而酒廠B 的Mucor 含量明顯高于其他組，Candida 含量明顯低于其他組。同時，Bullera 在6 個酒廠酒曲中含量都比較高。

圖4 屬水平上微生物差異性

3 結論

海南山蘭米酒酒曲中細菌和真菌組成較為豐富，真菌主要有根霉屬（Rhizopus）、假絲酵母屬（Candida）、Bullera、Simplicillium、曲霉屬（Aspergillus）、Gibberella，其中根霉屬是酒曲中真菌的優勢菌屬，這與泰國甜酒和陜北傳統米酒一致；細菌層面主要有片球菌（Pediococcus）、腸桿菌屬（Enterobacter）、魏斯氏菌Weissella、Klebsiella 等，其中片球菌含量最多。通過酒曲的細菌和真菌的Alpha 和Beta 多樣性分析以及聚類分析，酒廠E 的細菌群落物種豐富度和均勻度都比較高，而酒廠C 的細菌群落豐富度較低，真菌群落多樣性較高；通過熱圖發現6 個酒廠的酒曲中片球菌（Pediococcus）、Bullera 含量普遍都比較高，這可能與山蘭米酒的發酵密切相關；酒廠B 和C的細菌群落結構和其他酒廠具有顯著差異，酒曲某些菌屬Weissella、Bacillis、Cronobacter、Enterobacter、Klebsiella 等含量存在一致性，可以進一步深入研究。本研究揭示了山蘭米酒細菌和真菌群落組成和不同酒廠酒曲菌屬的差異，明確酒曲中的優勢菌種，為山蘭米酒工業化生產提供理論指導。

圖3 酒曲樣品的Beta 多樣性