常規水解法和氧化水解法對飼料及飼料原料中含硫氨基酸測定結果的比較分析

賀習文，李 宏，高勤葉，汪軍明，王 佳，郭 爽

（1.陜西秦云農產品檢驗檢測有限公司，陜西 渭南 714000；2.農業農村部飼料質量監督測試中心，西安 710016）

氨基酸是構成動物營養所需蛋白質的基本物質。氨基酸在動物體內通過代謝，可以合成動物組織的蛋白質，以及合成體內必須的酸、抗體、激素等含氨物質，除此之外，氨基酸還能轉變為碳水化合物和脂肪，為動物提供必須的能量，所以氨基酸對動物的生長、繁殖和哺乳有著至關重要的作用[1]。

目前已知的氨基酸種類有200多種，飼料中比較常見的有天冬氨酸、絲氨酸、蘇氨酸等17種常規氨基酸，在這17種常規氨基酸中，蛋氨酸和胱氨酸屬于含硫氨基酸，含硫氨基酸對生長發育階段的畜禽有著顯著的影響，在日糧中添加適量的含硫氨基酸可以顯著提高生產性能，因此對飼料中含硫氨基酸含量的監控顯得尤為重要[2-5]。含硫氨基酸的測定方法中，有GB/T 18246-2000“飼料中氨基酸的測定”中的常規水解法和GB/T 15399-1994“飼料中含硫氨基酸測定方法——離子交換色譜法”中的氧化水解法[6-7]。于淑新等利用高效液相色譜-柱前衍生化法測定飼料中的含硫氨基酸，農晉琦等利用氣相色譜法測定結合態含硫氨基酸[8-9]。

常用測定飼料及飼料原料中的含硫氨基酸的方法為常規水解法和氧化水解法，但在實驗中發現這兩種方法往往會出現兩種不同的結果[10-12]。本試驗利用GB/T 15399中氧化水解法和GB/T 18246-2000中的常規水解法兩種方法來對飼料及飼料原料中的含硫氨基酸進行測定，旨在探討哪一種前處理方法對含硫氨基酸的測定結果最佳，為飼料和飼料原料中含硫氨基酸的測定方法的選擇提供參考。

1 試驗原理、材料及方法

1.1 試驗原理

1.1.1 常規水解法原理

常規水解法是使飼料蛋白在110℃、c（HCl）=6 mol·L-1鹽酸作用下，水解成單一氨基酸，再經離子交換色譜法分離并以茚三酮做柱后衍生測定。

1.1.2 氧化水解法原理

飼料中的含硫氨基酸（胱氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸）用過甲酸氧化并經鹽酸水解生成磺基丙氨酸和蛋氨酸砜，此二物可用離子交換色譜法分離測定。

1.2 試驗材料

1.2.1 試劑及溶液

鹽酸（優級純）；檸檬酸三鈉（分析純）；硫二甘醇（分析純）；苯酚（分析純）；過氧化氫（30%優級純）；甲酸（88%分析純）；硝酸銀（分析純）；偏重亞硫酸鈉（分析純）；氫氧化鈉（分析純）；一級水。

6 mol·L-1鹽酸溶液：量取500 mL鹽酸混入提前準備好的500 mL水中。

6.8 mol·L-1鹽酸溶液：量取567 mL鹽酸混入提前準備好的433 mL水中。

過甲酸溶液：將30%過氧化氫和88%甲酸按1∶9的體積比混合，在室溫中放置1 h，冰水浴中放置30 min，臨用前配制（濃縮料需按3 mg·mL-1加入硝酸銀）。

偏重亞硫酸鈉溶液：稱取33.6 g偏重亞硫酸鈉加水定容至100 mL，臨用前配制。

檸檬酸鈉緩沖液（pH=2.2）：稱取檸檬酸三鈉19.6 g，用水溶解后加入鹽酸16.5 mL，硫二甘醇5.0 mL，苯酚1 g，加水定容至1 000 mL。

100 nmol·L-1混合氨基酸標準工作液：含有磺基丙氨酸、蛋氨酸砜、天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸等20種氨基酸標準工作液。

1.2.2 儀器及設備

德國曼默博爾A300氨基酸分析儀（570 nm和440 nm雙波長）；恒溫干燥箱；十萬分之一天平；萬分之一天平；旋轉蒸發儀；渦輪混合器。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗用樣品

雞用配合飼料、豬用濃縮飼料、魚粉、肉粉、豆粕、谷氨酸渣共6種不同基質樣品，通過旋風磨粉碎，全部通過60目的樣品篩，混合均勻，保存在4℃的冰箱中冷藏。

1.3.2 前處理方法

樣品按照GB/T 18246-2000中常規水解法，稱取100 mg樣品于水解管中，加入6 mol·L-1鹽酸溶液10.0 mL，置液氮中冷凍后抽真空封口，放在恒溫干燥箱中110℃下水解24 h，冷卻，搖勻，過濾，吸取約0.3～0.5 mL試樣液于旋轉蒸發儀上蒸發至干，加少許水重復蒸發至干，再加入3～5 mL檸檬酸鈉緩沖液（pH=2.2）溶解，渦輪混合，過0.22μm水相膜后上機測定。

樣品按照GB/T 15399-1994中氧化水解法，稱取50 mg樣品于水解管中，加入冷卻后的過甲酸溶液2 mL，放置在0℃冰水浴中反應16 h，取出后加入偏重亞硫酸鈉溶液0.5 mL，劇烈搖勻以終止反應，再加入6.8 mol·L-1鹽酸溶液17.5 mL，封口，放在恒溫干燥箱中110℃下水解24 h，冷卻，搖勻，過濾，吸取試樣液約0.3～0.5 mL于旋轉蒸發儀上蒸發至干，加少許水重復蒸發至干，再加入檸檬酸鈉緩沖液（pH=2.2）1～2 mL，溶解，渦輪混合，過0.22μm水相膜后上機測定。

2 試驗結果

2.1 色譜圖比較

按照2.3中的試驗方法，分別取配合飼料、濃縮飼料、魚粉、肉粉、豆粕、谷氨酸渣等不同的樣品，按照GB/T 18246常規水解法和GB/T 15399氧化水解法分別對含硫氨基酸進行定性、定量分析。為雞用配合飼料用兩種方法所做試驗的圖譜見圖1～2。

圖1 雞用配合飼料常規水解法圖譜

圖2 雞用配合飼料氧化水解法圖譜

由圖1和2可知，胱氨酸和蛋氨酸經過過甲酸溶液氧化后，再經過110℃的鹽酸溶液水解，已經完全轉換為磺基丙氨酸和蛋氨酸砜，通過對磺基丙氨酸和蛋氨酸砜的計算，從而得到胱氨酸和蛋氨酸的實際含量。通過對不同樣品進行實驗，得到的實驗數據如表1所示。

使用常規水解法和氧化水解法分別測定飼料及飼料原料中含硫氨基酸時，氧化水解法檢測的胱氨酸和蛋氨酸的值明顯比常規水解法高，只有魚粉及肉粉等動物性原料的蛋氨酸差距很小，兩種方法的偏差都在允許誤差之內。

2.2 精密度和穩定性比較

表1中的魚粉1樣品為能力比對樣品，將魚粉1樣品用常規水解法和氧化水解法分別處理8組平行樣品，得到的蛋氨酸結果和相對標準偏差RSD如表2。

由表2可知，同時處理8組平行樣品，氧化水解法的RSD為1.7%，常規水解法的RSD為2.0%，氧化水解法明顯優于常規水解法。

2.3 回收率比較

魚粉1樣品為有準確檢測數值的質控樣品，其胱氨酸的實值為0.57，誤差為±0.06，蛋氨酸的實值為1.72，誤差為±0.24，用氧化水解法和常規水解法分別對魚粉1樣品中的胱氨酸和蛋氨酸進行檢測，得出的結果和回收率見表3。

由表3可知，兩種方法同時檢測魚粉中的含硫氨基酸，結果表明常規水解法檢測胱氨酸的回收率為61.4%，蛋氨酸的回收率為103.5%；氧化水解法檢測胱氨酸的回收率為96.4%，蛋氨酸的回收率為102.9%，氧化水解法明顯優于常規水解法。

表1 不同樣品常規水解法和氧化水解法的實驗數據 %

表2 兩種方法得到的蛋氨酸結果和相對標準偏差RSD

表3 兩種方法檢測含硫氨基酸的實測值和回收率 %

3 結果與討論

試驗結果表明，使用常規水解法和氧化水解法分別測定飼料及飼料原料中含硫氨基酸，氧化水解法檢測6種不同基質樣品的胱氨酸和蛋氨酸值明顯高于常規水解法，其中魚粉及肉粉等動物性原料的蛋氨酸差距不大，兩種方法檢測的值都在允許誤差之內。另外以質控樣品作為參考，分別使用兩種方法測定其含硫氨基酸，結果表明，氧化水解法檢測的結果比常規水解法要更加準確，回收率更高，且穩定性更好，更適用于飼料及飼料原料中含硫氨基酸的檢測。目前有很多測定飼料中含硫氨基酸含量的新方法，但對測定儀器和操作人員的要求較高[13-16]。因此，建議濃縮飼料、配合飼料、豆粕等植物性飼料采用氧化水解法測定含硫氨基酸，肉粉、魚粉、羽毛粉等動物性飼料及原料采用氧化水解法測定胱氨酸，采用常規水解法測定蛋氨酸。這樣能夠為實驗者提供方法選擇參考，同時因為常規水解法操作簡單，能夠節省時間和試劑材料，有良好的使用價值。