發酵香腸風味物質氣質分析及與發酵時間的關系

李 佳 劉忠義U - 付 滿 劉紅艷U - 吳小艷 - 李 汀

(1. 廣西高校北部灣特色海產品資源開發與高值化利用重點實驗室〔北部灣大學〕，廣西 欽州 535000； 2. 湘潭大學化工學院，湖南 湘潭 411105)

發酵肉制品在發酵及成熟過程中，由于微生物的發酵作用，使得蛋白質、糖類和脂肪降解，產生多種揮發性成分如烷烴類、醇類、醛類、酮類、酯類、酚類等化合物[1-2][3]2,39-40。這些風味物質的存在很可能決定了產品的感官風格，是評價香腸品質的重要指標。

頂空(HS)—固相微萃取(SPME)技術是提取樣品揮發性風味物質的處理技術，具有快速簡便、無需溶劑萃取以及使用條件溫和的優點[2,4]，可直接與氣相—質譜連接鑒定揮發性風味組分。目前，SPME處理技術已廣泛應用于發酵肉制品[2][3]3-5、香精香料以及其他各類食品中揮發性化合物成分的分析[4-6]。

傳統的發酵肉制品一般在低溫環境經過長時間的發酵和干燥，風味獨特[2][3]5,12,25，但是生產加工周期很長，菌相復雜，且成本高昂。因此，非常有必要接種人工菌種，改進加工工藝，提高發酵肉制品的食用安全性，縮短發酵生產時間。有試驗表明，在32 ℃的溫度下，添加人工發酵劑發酵6～9 h可以獲得高食用安全品質的發酵香腸[7]；在添加人工發酵劑，大幅度縮短發酵生產時間，低于30 g/kg食鹽添加量的條件下，也能很好保障產品的食用安全性[8]。

盡管已有不少關于傳統發酵肉制品或者半發酵肉制品的相關風味研究[1-2][3]2-5，但是基本上是以成品為研究對象，而發酵時間與肉制品風味的關系研究較少見，尤其是基本未見接種純培養物短時間發酵即完成發酵的發酵肉制品的風味研究。本研究擬采用SPME技術并結合氣相-質譜(GC-MS)對32 ℃發酵6 h及9 h香腸的揮發性成分進行分析和鑒定，并對2種香腸的風味品質與質量做進一步的比較和判斷，以期為發酵香腸的技術應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

新鮮豬肉：湘潭大學購物中心；

乳酸菌發酵劑：3.12×109CFU/g，北京川秀科技有限公司；

酵母發酵劑：3.95×109CFU/g，安琪酵母股份有限公司；

腸衣：譚氏百盛電子商務有限公司；

五香粉、姜粉：食品級，上海味好美食品有限公司；

紅曲粉：食品級，上海佳杰天然食品色素有限公司；

磷酸鹽：食品級，市售；

白糖：食品級，廣州福正東海食品有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

氣相色譜—質譜聯用儀：GCMS-QP2010Plus型，美國安捷倫公司；

電子分析天平：PTX-FA-110型，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 發酵香腸的制備 參照文獻[8]。

(1) 香腸配方(質量分數，以肉總量百分比計)：2.0%食鹽，0.2%味精，0.3%胡椒粉，0.2%姜粉，0.2%五香粉，2.4%白糖，0.1%紅曲粉，0.1%磷酸鹽，0.8%醬油，2.4%黃酒。

(2) 制備方法：瘦肉加入準備好的腌制劑在2 ℃冷藏柜腌制18 h；然后肥、瘦肉按照5∶3的比例混合，加入質量分數0.08%(以肉總量百分比計)乳酸菌和0.04%酵母后灌腸，將其置于(32±1) ℃、相對濕度75%～80%下發酵6 h或者9 h；然后在(70±1) ℃的恒溫箱中干燥2 h。

1.2.1 GC-MS分析樣品的制備 分別將發酵6，9 h的香腸絞碎，稱取一定量的樣品置于萃取瓶內，密封后將SPME(50 μm PDMS)針管穿透萃取瓶隔墊，插入瓶內，推動手柄使萃取頭伸入樣品上部完成頂空吸附過程，應保證萃取纖維頭不要觸碰到樣品，且每次試驗萃取頭與樣品距離一致，在規定條件下恒溫水浴加熱，萃取完畢迅速插入GC進樣口，解析5 min后，取出SPME手柄及萃取頭。

1.2.2 色譜條件 毛細管柱(DB-5，60 m×0.25 mm，0.25 μm)；柱溫 40 ℃保持 5 min，再以20 ℃/min程序升溫到120 ℃，而后以5 ℃/min程序升溫到190 ℃，之后以0.5 ℃/min程序升溫到198 ℃，最后以5 ℃/min程序升溫到250 ℃，保持5 min。進樣口溫度250 ℃；載氣(He)流量1 mL/min；解析溫度250 ℃；不分流模式進樣。

傳輸線溫度280 ℃；四級桿溫度150 ℃；離子源溫度230 ℃；掃描范圍m/z33～450；電離電壓70 eV。

1.2.3 SPME萃取條件單因素試驗 參照文獻[2,9]，在確定解析時間為5 min的前提下研究取樣量(2.5，3.0，3.5，4.0，4.5 g 5個梯度，萃取時間50 min，萃取溫度60 ℃)、萃取時間(35，40，45，50，55 min 5個梯度，樣品量3.0 g，萃取溫度60 ℃)、萃取溫度(50，55，60，65，70 ℃ 5個梯度，選取樣品量3.0 g，萃取時間50 min)3個因素對萃取效果的影響。將總峰面積設為主要考察指標，有效出峰數(相對峰面積≥0.1%)設為輔助指標。

1.2.4 發酵香腸樣品的分析 按照前述單因素試驗得出的最佳萃取條件分別對32 ℃發酵6 h和9 h 2種香腸樣品揮發性物質進行萃取后，直接在GC-MS上機分析。

1.2.5 數據處理 所有試驗重復3次。用SPSS statistix 16.0統計分析軟件進行均值計算及方差分析，數值以(均值±標準差)表示，P<0.05即表示差異顯著。作圖采用Origin 8.5。

2 結果與分析

2.1 取樣量對萃取效果的影響

受樣品的揮發性化合物種類、萃取瓶的容量等因素的影響，樣品的質量會影響萃取效果。如圖1所示，樣品量從2.5～3.0 g時，隨著樣品質量的提高，出峰面積和數量隨之增加；此后，當樣品質量進一步增加時，出峰面積和數量隨之下降。萃取涂層對萃取品種揮發性風味物質的吸附量與其在瓶內的濃度有關[2,9]，當萃取品內揮發性化合物濃度較低時，增加其濃度能增加其萃取量。然而，固相微萃取頭的吸附量與萃取瓶的有效空間有關[2,9]，當樣品質量達到3.0 g以上時，樣品占了瓶內較大的空間，擠占了萃取瓶的有效空間，導致出峰面積反而降低，且此時相對面積占優勢的峰所對應的物質相對濃度更高，會影響相對濃度低的物質的吸附，因此，出峰數量會同時減小。

圖1 樣品質量對萃取效果的影響

2.2 萃取時間對萃取效果的影響

如圖2所示，隨著萃取時間的延長，出峰面積和數量在35～50 min范圍內呈增加趨勢，萃取時間為50 min時，峰面積達到最大值。而當萃取時間增加到55 min時，峰面積略有上升，但出峰數量略有減少。由于揮發性物質在萃取頭、頂空相、介質相存在擴散分配過程，SPME萃取纖維頭需要一定的時間才能達到吸附平衡[9]，因此萃取初期吸附量增加會較為迅速，隨著時間的延長，萃取頭上吸附的物質又逐漸解吸，長時間的萃取對萃取涂層有一定的損耗以及可能導致組分之間發生化學反應，萃取時間到55 min時，峰面積增加，但出峰數量卻有所下降，可能是萃取頭上部分物質的解吸，但個別揮發性較好的化合物濃度快速增加，因此出現峰面積增加但出峰數量卻略有降低，故此選擇50 min萃取時間為宜。

2.3 萃取溫度對萃取效果的影響

如圖3所示PDMS，不同溫度下具有不同的萃取效果，萃取溫度在60 ℃時具有最大的峰面積和數量，在此溫度上隨著溫度的減少和上升，峰面積均呈下降趨勢，但高于此溫度，峰面積下降的速率變緩。各揮發性物質在各相之間的分配及速度也受溫度影響，溫度升高加快了瓶內揮發性物質分子的熱運動，有利于擴散，但溫度進一步升高可能使風味物質之間發生熱聚合反應[2]。根據試驗結果，選擇60 ℃萃取溫度較為合適。

圖3 萃取溫度對萃取效果的影響

2.4 發酵香腸揮發性成分分析

2.4.1 發酵香腸中檢出的揮發性成分 發酵香腸的揮發性物質的總離子流圖見圖4，風味成分種類與其相對含量見表1。

圖4 發酵香腸的揮發性化合物總離子圖

2.4.2 2種香腸中揮發性成分的差別 如表1和表2所示，發酵6 h的香腸中相對含量最多的是酯類物質，其后依次是醇類、酸類、醛類、烷烴、酮類，而發酵9 h香腸中相對含量最多的為醇類(主要是乙醇)、其次為酮類、酯類、烷烴類、酸類、醛類。

發酵6 h的發酵香腸中鑒定出的揮發性風味成分有54種，主要包括烷烴類物質5種，醛類2種、酯類19種，酮類4種、醇類9種、酸類4種、以及相對峰面積合計達43.39%的11種其他類別的化合物(包括胺類、萜烯類、含硫化合物、苯酚類及醚類物質)，在發酵香腸中，脂環化合物具有濃郁的肉香味[10-12]；其次是酯類物質，共19種，占總揮發性風味含量18.90%。酯類可能來源于脂質、蛋白質分解氧化反應及其 Strecker 降解和 Maillard反應[13]，此外也可能源自乳酸菌和酵母菌的發酵。含硫化合物2-苯胺基苯硫酚可能是硫胺素降解或者一些含硫氨基酸如蛋氨酸、半胱氨酸、胱氨酸產生[14]，其閾值較低但含量不高。

與發酵6 h相比，發酵9 h的發酵香腸中的香氣成分存在明顯的差別，測定出的揮發性風味成分種類數目大幅減少，共20種，其中，相較發酵6 h的香腸而言，酯類香氣成分種類數大幅減少，從發酵6 h時的18種減至2種，僅為總含量的4.52%；醇類物質含量發酵到9 h,其種類數從9種降到了4種，相對含量卻增加到了74.37%。醇類物質的相對含量增加主要是由于酵母的發酵導致乙醇含量大幅增加，而種類數的減少則可能由于發生酯化反應或氧化反應[15]，導致其他醇類相對含量降低，在分析過程中被其他物質所掩蓋而未被檢測到。相對含量過高的乙醇還可能是導致發酵9 h香腸中揮發性物質被檢出種類大幅減少的關鍵原因。

表1 2種香腸的主要揮發性風味物質及其相對含量

表2 兩種香腸中揮發性風味物質的差別

(1) 酯類：發酵6 h的香腸中含有較為豐富的酯類物質，共計檢出19種之多，與目前有關于發酵香腸的研究[10-14]差異極大，可能是由于發酵以及干燥的時間不同所導致的。本試驗中發酵9 h的香腸中也只檢出6-己內酯和己二酸雙2-丁氧基乙酯2種脂類化合物。酯類多具有花香和水果香，對風味具有特殊的貢獻。有研究[16]表明，腌制火腿的特征風味與乙酯類物質(尤其是帶甲基支鏈的短鏈酯)有關。發酵6 h的香腸中己二酸二丁氧基乙酯在香腸中的相對峰面積最高，達到了4.16%。此外，在發酵6 h的香腸中，還檢測出了6-己內酯、1,5-辛內酯、硬脂酸異丙內酯，其相對峰面積達到了0.65%。內酯類化合物對許多食品賦予了桃子、椰子等果香味，甚至在稀釋之后還會散發出另一種水果的香味[17]。在酯類物質的種類和相對峰面積上，6 h的發酵香腸具有明顯的優勢。

(2) 醇類：醇類主源于糖類的微生物發酵代謝及脂肪的氧化，香腸發酵過程中產生的脂肪酶對這一過程影響顯著，從而影響產品的最終風味[18-19]。發酵6 h的香腸中醇類物質的種類更為豐富，發酵9 h后的香腸則在相對峰面積上高得多，且主要是以乙醇的形式存在。醇類物質中的芳香醇也可能來自天然香辛料。發酵6 h的香腸中檢出松油醇、薄荷醇和(+)-雪松醇，芳香醇類揮發性物質的閾值通常較低，即較低的含量便能表現出較強的風味特征，因此這些物質在風味構成中的作用也不容忽視；脂肪醇主要有芳樟醇(具檸檬香味，又具有濃青帶甜的木青氣息，似玫瑰木香氣，更似剛出爐的綠茶青香，既有紫丁香、鈴蘭香與玫瑰的花香，又有木香、果香氣息)、法尼醇和三甲基戊醇等，脂肪醇揮發性相對較弱。發酵9 h后的香腸乙醇占了70.92%，同時檢出了4-庚醇及2,5-二甲基-3,4-己烷二醇(發酵6 h香腸中未檢出)。大多數醇類物質閾值較高，但具有甜香味，并且對醛類、酯類物質產生是必不可少的，對香腸整體風味具有改善作用。

(3) 酸類：酸類物質對酯類物質的生成至關重要，另外，產品的風味復雜性及獨有的感官風味特點也離不開酸類物質。發酵9 h的香腸的種類和數目較發酵6 h的香腸有一定的差異。兩組中均檢出共同成分棕櫚酸和乙酸，但發酵6 h香腸中還檢出肉豆蔻酸、硬脂酸，而發酵9 h 香腸中則還檢出酮丙二酸。

(4)酮類和醛類：酮類物質一般由美拉德反應產生，酮類物質風味成分一般呈奶油味[20]，并且閾值較低，是重要的香氣成分[21]。發酵6 h和發酵9 h腸中主要揮發性風味物質3-羥基-2-丁酮，其相對峰面積分別為4.32%和6.89%，發酵6 h腸中還檢測到一定的4-辛酮、4-丁基-2-氧雜卓酮、2-十九烷酮。酮類物質是醇的氧化產物或酯類分解產物，2種腸中酮類物質的差異可能與酯類物質的含量有關。

值得一提的是，醛類化合物在兩種腸中種類都較少，發酵6 h的香腸中檢出壬醛和枯茗醛，其相對含量為1.89%，發酵9 h香腸中僅檢出相對含量為0.22%的壬醛。壬醛呈青草和生脂肪味，枯茗醛呈青草香和藥草香[22]。

(5) 其他化合物：發酵6 h和9 h腸中均檢出5種烴類物質，含兩種共同成分。烴類化合物通常都具有高芳香閾值，對于香腸的整體風味貢獻不大。

其他類型的揮發性物質主要包括胺類5種、萜烯類3種、醚類3種、苯酚類2種。

香腸中的萜烯類物質主要來源于添加的香辛料，萜烯類物質通常為強呈昧的揮發性風味物質，具有一定的香辣味，在食品調味料中有廣泛的應用。在本試驗的腌制過程中，添加了白胡椒粉、五香粉、姜粉等香辛料，在6 h 發酵腸中檢測到了角鯊烯、8-甲基-1-癸烯和2,6-二甲基庚-1,5-二烯，其相對含量占總揮發性物質0.64%，但9 h發酵腸中并未檢測到，可能與這類物質較強的揮發性有關，這與張春暉的研究結果很類似[23]。

醚類中檢出的茴香腦也可能來源于添加的香料，具有八角茴香經典氣味。

發酵6 h未檢測出苯酚類物質，而發酵9 h檢出2-苯胺基苯硫酚、4-仲丁基-2,6-二叔丁基苯酚，占總揮發性風味物質0.28%，與一些發酵香腸研究不同的是，本試驗中苯酚類物質含量較低，主要是由于未采用煙熏工藝，少量的苯酚可能來源于苯甲醛和苯丙氨酸在微生物作用下的分解[24]。

風味物質的鑒定離不開人體嗅覺的感官分析，但使用儀器分析來檢測風味成分也非常重要[25]。試驗中發現發酵6 h的香腸在口感及風味上更為濃郁香醇，其感官評價得分值達81.2分；發酵9 h的香腸的口感及風味稍差，其感官評價得分值為79分，這種口感和風味上的差異利用HS-SPME-GC-MS技術分析得到了驗證。

3 結論

(1) 利用單因素分析方法，分析了取樣量、萃取時間、萃取溫度3個因素對萃取效果的影響，優化了SPME的萃取條件，即樣品質量為3.0 g、萃取時間為50 min，萃取溫度為60 ℃。

(2) 在優化的萃取條件下，利用HS-SPME-GC-MS技術分析比較了發酵6 h和9 h香腸揮發性風味物質的差異。發酵6 h的發酵香腸中被鑒定出的揮發性風味成分有54種，包括烷烴類物質5種、酯類19種，酮類4種、醛類2種、醇類9種、酸類4種以及胺類、萜烯類、含硫化合物、苯酚類及醚類等其他類別的化合物11種；發酵9 h的發酵香腸中被鑒定出20種揮發性風味物質，其中烷烴類5種、酯類2種、酮類1種、醛類1種、醇類4種、酸類3種及其他類化合物4種。各香氣成分中的相對含量也有明顯差異性。數據顯示，兩種香腸揮發性成分組成差異比較大，發酵6 h香腸在風味成分的種類及成分上更具優勢。

(3) 進一步的研究將針對不同益生菌菌種及不同菌種組合對發酵風味的影響，確定對特征發酵風味具有關鍵作用的主香成分，以及接種發酵香腸保藏過程中的風味變化。