茶渣蛋白糖基化改性工藝優化及功能特性研究

楊 旭 任 珍

(1. 安康學院現代農業與生物科技學院，陜西 安康 725000；2. 陜西省富硒食品工程實驗室，陜西 安康 725000)

茶渣是茶葉經沖泡飲用或活性成分提取加工后的副產物[1]，含有豐富的纖維素、木質素、蛋白、多酚、多糖、皂素等功效成分[2-3]。茶渣中蛋白約15%～30%[4]，且以堿溶性蛋白為主，占蛋白總量的55.06%[5]。研究表明，茶渣蛋白具有高的疏水性，溶解度較差[6]39[7]1-2，因此乳化性、乳化穩定性、表面張力和黏度等功能性質方面不利于在食品中的應用。

為了提升茶渣蛋白的功能特性，目前已報道的改性方法有限制性酶解法和擠壓膨化法。王洪新等[8]利用酶法水解改性后，茶渣蛋白的溶解性、起泡性、乳化性提高，但泡沫穩定性和乳化穩定性均有所降低。黃夢姣等[9]通過擠壓改性法，使綠茶渣的水溶性提高了7.41%，但擠壓膨化中高溫高壓對產品的色澤、營養價值等的不良影響，使其他改性方法的探究具有發展空間。

糖基化改性是利用蛋白質—糖的接枝反應形成共價復合物，實現對蛋白質的化學改性。此方法已應用于燕麥[10]、米渣[11]、玉米[12]等蛋白的改性，但在茶渣蛋白中的應用還未見報道。本試驗擬以濕法糖基化對茶渣蛋白進行改性，探究糖基供體種類、反應物比例、pH、溫度和時間對糖基化效果的影響，并分析改性前后茶渣蛋白的溶解性、乳化性和乳化穩定性、起泡性和泡沫穩定性的變化情況。以期為糖基化改性法在茶渣蛋白中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

綠茶：安康市紫陽縣向陽茶廠；

葡萄糖、葡聚糖、乳糖、麥芽糊精：分析純，北京酷爾化學科技有限公司；

牛血清白蛋白標準品：純度≥98%，上海江萊生物科技有限公司；

其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設備

紫外可見分光光度計：TU-1901型，北京普析通用儀器有限責任公司；

低速離心機：LD4-2A型，北京醫用離心機廠；

恒溫振動水浴鍋：SHA-C型，常州國華電器有限公司；

電熱恒溫鼓風干燥箱：GZX-GF101-2-BS型，上海躍進醫療器械有限公司；

真空冷凍干燥機：SCIENTZ-50N型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

旋轉蒸發儀：RE-52AA型，上海亞榮生化儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 原料預處理 綠茶原料以料液比1∶110(g/mL)加水于85 ℃下沖泡30 min，重復2次[13]，抽濾后剩余的茶渣在50 ℃下干燥至恒重，粉碎過60目篩，備用。

1.2.2 茶渣蛋白的提取 根據預試驗所得的優化提取工藝，茶渣樣品用0.075 mol/L NaOH溶液以1∶60(g/mL)的料液比在54.2 ℃下水浴振蕩提取4 h，浸提液經添加4%雙氧水在50 ℃下脫色，并于pH 3.5下等電點沉淀后，冷凍干燥。

1.2.3 糖基供體的選擇及評價指標測定

(1) 茶渣蛋白—糖的共價復合物制備：參考王成波[14]的方法略作修改。以0.075 mol/L NaOH溶液復溶茶渣蛋白，使蛋白質量濃度為1.2%，取20 mL按1∶1的質量比加入不同糖基供體，磁力攪拌20 min使其混合均勻。用0.1 mol/L HCl溶液或0.1 mol/L NaOH 溶液調節pH至11.0，磁力攪拌5 min。將茶渣蛋白—糖混合液置于90 ℃下水浴加熱反應一定時間，并在冰浴中冷卻5 min 以終止反應，所得樣品液于4 ℃冷藏待用。

(2) 接枝度測定：采用鄰苯二甲醛法[15]。

(3) 褐變指數測定：參照Sun等[16]的方法，以反應體系在420 nm下的吸光度值為褐變指數。

(4) 溶解性測定：根據張蓓等[10]的方法修改如下，將共價復合物樣品液冷凍干燥后，配制成1 mg/mL復合物溶液，9 000 r/min離心15 min，采用考馬斯亮藍G-250法測定上清液中的蛋白質含量，并按式(1)計算溶解性。

(1)

式中：

SI——溶解性，%；

P1——上清液中蛋白質含量，μg/mL；

P0——樣品中總蛋白質含量，μg/mL。

(5) 乳化性及乳化穩定性測定：參照文獻[17]，配制1 mg/mL的共價復合物樣品液進行測定。

(6) 起泡性及泡沫穩定性測定：參照文獻[18]，配制1 mg/mL的共價復合物樣品液進行測定。

1.2.4 茶渣蛋白—糖共價復合物的制備工藝優化

(1) 茶渣蛋白與糖的質量比對糖基化效果的影響：將茶渣蛋白與選擇的糖基供體分別按照2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶4的質量比進行混合，在90 ℃、pH 11.0條件下反應2 h，其他步驟按1.2.3(1)所述制備共價復合物。

(2) 體系pH對糖基化效果的影響：將茶渣蛋白與選擇的糖基供體按照1∶1的質量比進行混合，分別調節pH至8.0，9.0，10.0，11.0，12.0，于90 ℃下反應2 h，其他步驟按1.2.3(1)所述制備共價復合物。

(3) 溫度對糖基化效果的影響：將茶渣蛋白與選擇的糖基供體按照1∶1的質量比進行混合，調節pH至11.0，分別于60，70，80，90，100 ℃下反應2 h，其他步驟按1.2.3(1)所述制備共價復合物。

(4) 響應面試驗設計：根據單因素試驗結果，以質量比、pH和反應溫度為自變量，接枝度為響應值，進行三因素三水平的Box-Behnken響應面試驗。

1.2.5 數據分析 所有數據以(均值±標準差)表示，每次樣品的測定均重復3次。采用SPSS 19.0進行方差分析和差異顯著性分析(P<0.05即為差異顯著)。其中，響應面設計試驗數據以均值表示，采用Design Expert 8對數據進行二次多項式回歸擬合分析。

2 結果與分析

2.1 糖基供體的確定

2.1.1 不同糖基供體的糖基化效果分析 圖1為茶渣蛋白分別與葡萄糖、葡聚糖、乳糖、麥芽糊精在0～4 h反應過程中接枝度的變化曲線。隨著反應時間的延長，接枝度均呈先增加后降低的趨勢。4種糖基供體中，乳糖的接枝度最高，反應1 h即為(35.38±0.79)%，其次為葡萄糖，反應2 h后達到最高接枝度(31.58±0.83)%，而葡聚糖和麥芽糊精在受試時間內的接枝度均未超過15%。葡萄糖、乳糖含有較多的還原性羰基，更容易與茶渣蛋白發生接枝反應，而葡聚糖、麥芽糊精的相對分子質量較大，支鏈的空間位阻效應則限制了反應的進行[10]。

圖1 反應時間對不同茶渣蛋白—糖復合物接枝度的影響

Figure 1 Effect of reaction time on the graft degree of the different tea residue protein-saccharide complexes

茶渣蛋白與葡萄糖、葡聚糖、乳糖、麥芽糊精進行糖基化反應的時間對產物褐變指數的影響如圖2所示。4種糖基供體產物褐變指數的變化趨勢一致，在0～4 h反應時間內不斷增大，且表現為：葡萄糖>乳糖>麥芽糊精>葡聚糖。結果表明，葡萄糖和乳糖與茶渣蛋白的反應更為劇烈，能夠較快進入美拉德反應的高級階段，從而形成褐變物質[19 ]。

2.1.2 不同糖基供體的產物功能特性分析 表1為不同糖基供體與茶渣蛋白形成共價復合物的功能特性測定結果。從表1中數據可知，茶渣蛋白—葡萄糖復合物的溶解性、乳化性和起泡性明顯高于其他3種糖基供體，而乳化穩定性與泡沫穩定性則是葡聚糖最高，葡萄糖次之。

圖2 反應時間對不同茶渣蛋白—糖復合物褐變 指數的影響

Figure 2 Effect of reaction time on the browning index of the different tea residue protein-saccharide complexes

表1 不同茶渣蛋白—糖復合物的功能特性?

? 同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

因此，綜合接枝度、褐變指數、功能特性各項指標，最終選擇葡萄糖作為茶渣蛋白糖基化改性的最適糖基供體。

2.2 茶渣蛋白—糖共價復合物制備的工藝優化

2.2.1 單因素試驗

(1) 茶渣蛋白與糖的質量比對糖基化效果的影響：由圖3可知，開始時，隨著葡萄糖的添加比例增大，反應底物間的接觸增多，加速了美拉德反應的進程，接枝度在茶渣蛋白與糖的質量比為1∶1時達到最大值，為(31.15±0.51)%。而后此作用效果減弱，加之體系黏度隨葡萄糖的添加比例增大而提高，導致底物間的接觸反而受到限制。褐變指數卻隨質量比的增大而呈現不斷上升的趨勢，且在質量比超過1∶3時上升幅度增大，可能與副反應(如焦糖化)的發生有關[11]。因此，確定茶渣蛋白與葡萄糖的適宜質量比為1∶1～1∶3。

圖3 茶渣蛋白與葡萄糖的質量比對糖基化效果的影響

(2) 體系pH對糖基化效果的影響：由圖4可知，隨著體系pH的不斷增大，接枝度呈先增加后降低的趨勢，而褐變指數則持續上升。當pH為11.0時，接枝度達到最大值，為(31.86±0.81)%。由于提取得到的茶渣蛋白為堿溶性，pH值的提升促使蛋白質的溶解性增加，有利于反應的進行。隨后，極端pH值使氨基的反應性降低，枝度有所下降，但茶渣中的多酚與蛋白質等物質在堿性、濕熱作用下的氧化反應會加劇褐變程度。因此，確定反應體系的適宜pH為10～12。

圖4 體系pH對糖基化效果的影響

(3) 溫度對糖基化效果的影響：由圖5可知，接枝度和褐變指數先隨反應溫度的升高而逐漸增加，當溫度為80 ℃時，兩個指標分別達到(31.88±0.54)%和(1.441±0.017)。此階段反應溫度的升高使蛋白質受熱展開，與葡萄糖的反應位點增加，反應加快。當蛋白分子上共價結合的糖鏈增長，位阻效應的存在使反應受到限制，同時過高的溫度也會使茶渣蛋白的營養價值降低，但高溫卻促使了焦糖聚合物的形成[20]，使褐變指數繼續升高。因此，確定適宜的反應溫度為70～90 ℃。

圖5 溫度對糖基化效果的影響

2.2.2 響應面試驗 根據單因素試驗的結果，糖基化效果的兩個衡量指標中，褐變指數是美拉德反應高級階段的重要表征，但褐變程度過大對產品的色澤會造成不利影響；接枝度則反映了共價復合物主鏈上葡萄糖的接枝程度，其越大越有利于接枝反應[21]。因此，以接枝度為響應值，進行三因素三水平的響應面試驗設計(表2)，具體試驗方案及結果見表3。

采用Design Expert 8軟件對試驗數據進行二次多項式回歸擬合，得到的回歸方程如下：

Y= 31.42-1.12A-1.49B+1.82C+0.11AB-1.08AC-0.30BC-1.34A2-2.06B2-3.49C2。

(2)

表2 Box-Behnken試驗設計因素水平表

表3 Box-Behnken試驗結果

表4 回歸模型的方差分析結果?

? *表示P<0.05，**表示P<0.01。

圖6為各因素交互作用對接枝度影響的響應面圖。通過該組圖的曲線走勢和等高線形狀，可反映出3個考察因素中任意兩個因素交互作用的強弱，其中茶渣蛋白與糖的質量比、反應溫度的交互作用對接枝度影響顯著，與方差分析結果一致。根據擬合的多元回歸方程，最終計算得到的最優組合為茶渣蛋白與糖的質量比1∶1.42、體系pH 10.60、反應溫度83.68 ℃，此時接枝度的理論值達到32.38%。為確定所得到的優化工藝對茶渣蛋白的改性效果，進行驗證實驗。此反應條件下，測得產物的接枝度為(32.89±0.53)%，與理論最佳值基本一致，說明此改性方案合理可行。

2.2.3 改性前后茶渣蛋白的功能特性測定 在優化的改性工藝基礎上，制備得到茶渣蛋白—葡萄糖共價復合物，分別測定改性前后蛋白質的功能特性，結果見表5。改性前，茶渣蛋白的溶解性僅為(55.31±1.41)%，與其較高的疏水性氨基酸含量有關；乳化性和對乳狀液的穩定能力分別為(0.205±0.007)%和(25.16±0.69)%，與夏秀芳等[17]報道的大豆分離蛋白的乳化性(0.160%)和乳化穩定性(25.75%)相當；起泡性較差，與其溶解性較差有關，而維持泡沫的穩定能力為(57.45±2.57)%。

經過糖基化改性后，測定的功能特性均有不同程度的提高。溶解性增加了35.78%，較溶解性增加24%的限制性水解法[7]40-41和7.41%的擠壓改性法[9]，效果更為理想。改性后茶渣蛋白的乳化性是改性前的3.02倍，乳化穩定性增加了10.72%，優于限制性水解改性后茶渣蛋白乳化性7%的提高和乳化穩定性的降低[6]34-35。起泡性增加了29.95%，不及酶法水解改性后起泡性的改善效果(增加79%)，泡沫穩定性雖較其他功能特性的提升不明顯，但優于酶法水解改性[8]。

圖6 因素交互作用對接枝度的影響

茶渣蛋白溶解性/%乳化性乳化穩定性/%起泡性/%泡沫穩定性/%改性前55.31±1.410.205±0.00725.16±0.69117.56±1.9057.45±2.57改性后91.09±1.850.620±0.01135.88±1.14147.51±2.5560.68±1.84

3 結論

本研究從糖基化反應的接枝度、褐變指數和蛋白功能特性3方面考察，選定葡萄糖為最適的糖基供體。以接枝度為響應值，茶渣蛋白與葡萄糖的質量比、體系pH和反應溫度為因子，通過響應面試驗設計建立二次多項回歸模型，確定茶渣蛋白的優化改性工藝為茶渣蛋白與葡萄糖的質量比1∶1、體系pH 10.60、反應溫度83.68 ℃。此改性條件下，茶渣蛋白的溶解性、乳化性及乳化穩定性、起泡性及泡沫穩定性較改性前均有提升，說明糖基化改性法可用于茶渣蛋白的功能特性改善。后續可對改性茶渣蛋白在具體食品模型中的應用進行研究，以利于茶渣資源的合理開發。