高效液相色譜法測定S-誘抗素及對其設計濃度驗證

姚晨濤 ，劉銘鈺 ，孫 曉 ，賈芳瑩 ，彭宇漩 ，姜興印 *

（1.山東農業大學植物保護學院，山東泰安 271018；2.山東農業大學環境毒理研究中心，山東泰安 271018）

農藥對控制作物病害、保證農作物的高產豐收發揮著重要作用[1]，但農藥的不合理使用也會對生態環境造成危害[2]。農藥進入田間后，一部分會通過不同環境介質匯集到水體中，降低水生生態環境的質量，影響水生生態系統，甚至整個生態系統的結構和功能[3]。在我國未來，現代農業仍離不開農藥。為了將農藥使用造成的危害與風險降到最低，對農藥進行毒性檢測已經成為評價水環境質量的重要環節。目前，生態風險評價已成為農藥環境安全管理的有力技術支撐，是我國農藥登記管理中必不可少的環節[4]。

斜生柵藻（Scenedesmus obliquus）是水體的初級生產者，它對生態系統的平衡和穩定起著十分重要的作用[5]。大型溞（Daphnia MagnaStraus）屬于浮游甲殼類動物，以藻類為食，是水生生態系統中物質循環和能量流動的重要環節。因其生活周期短、繁殖快、對毒物敏感及易于在實驗室培養等優點，目前已被廣泛應用于水體環境污染監測和水生生物毒性試驗和評價中[6]。魚類是水生生態系統的消費者，在食物鏈上與人類的關系最密切。斑馬魚（Barchydanio reriovar）是一種小型熱帶淡水魚，因其價格低廉、容易獲得、管理飼養易行等諸多因素引起環保組織重視，現已經將化學品對其急性、慢性毒性作為評價污染物對水生環境危害程度的指標[7]。

S-誘抗素（abscisic acid）是活性高、功能強大的植物內源生長調節物質[8-9]。其具有調節植物生長，改善農作物品質，提高作物生存能力等特性，廣泛用于農業生產的抗災減災、生態植被建設和農產品安全生產等領域。

關于S-誘抗素對3種水生生物的環境毒性評價尚未見報道，本試驗根據國家《化學農藥環境安全評價試驗準則》[10-13]研究S-誘抗素對3種水生生物的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1200 HPLC高效液相色譜儀（美國Agilent公司）、KQ-500DB型數控超聲波清洗器（昆山市定山湖檢測儀器廠）、QUINTIX125D-1CN型十萬分之一電子天平（德國賽多利斯公司）、甲醇（色譜純，美國Sigma公司）、98%S-誘抗素標準樣品（四川龍蟒福生科技有限責任公司）。

1.2 溶液配制

準確稱取98%S-誘抗素標準樣品0.025 51 g于小燒杯中，加入甲醇，移至50 mL容量瓶，定容，得500.0 mg/L的S-誘抗素儲備液。用甲醇稀釋配制成質量濃度為100.0、50.0、20.0、10.0、2.0、1.0 mg/L的S-誘抗素標準溶液。

1.3 水樣采集與處理

藻類生長抑制試驗各濃度處理重復3次，分別于0 h、72 h在水體中部取樣；溞類急性活動抑制試驗各濃度處理重復4次，分別于0 h、48 h水體中部取樣；魚類急性毒性試驗各濃度處理重復3次，分別于0 h、96 h水體中部取樣，重復混合后過0.22 μm水系濾膜，直接進樣，分別檢測不同時間水中樣品含量。

圖1 S-誘抗素標準樣品色譜圖及標準曲線

1.4 HPLC液相色譜條件

液相色譜柱：Pgrandsil-STC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇＋水（體積比60∶40），甲酸調溶液pH值為3；檢測波長：260 nm；柱溫：25℃，流速：1.0 mL/min，進樣量：20 μL。所用試劑和溶液進入色譜系統前經0.22 μm微孔濾膜過濾。

1.5 測定

在上述操作條件下，待儀器基線穩定后，注入數針標樣溶液，計算各針相對響應值的重復性，待相鄰2針S-誘抗素響應值變化≤1.5%時，再按照標樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標樣溶液的順序進行測定。

1.6 數據處理

將待測樣品溶液的峰面積值代入下列公式計算，得溶液中的有效成分質量分數。

式中：X為待測樣品溶液中有效成分質量濃度，單位為mg/L；C為標準樣品溶液中有效成分質量濃度，單位為mg/L；S1為待測樣品溶液峰面積值；S2為標準樣品溶液峰面積值。

2 結果與討論

2.1 方法的線性關系

S-誘抗素標準樣品色譜圖如圖1-A所示，出峰時間為9.283 min。以S-誘抗素標準溶液質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，S-誘抗素線性回歸方程為y=100 982x＋6 935.1，相關系數R2=0.999 8，結果見圖1-B。試驗結果表明，在質量濃度為1.0～100.0 mg/L時，S-誘抗素的質量濃度與相應的峰面積呈現的線性關系良好。

2.2 精密度、準確度的測定

試驗期間，空白對照中未檢測出待測樣品。精密度的測定方法為：稱取空白樣品1.0 g，分別加入質量濃度為2.0 mg/L的S-誘抗素標準溶液，每個添加水平下每個樣品平行測定3次，結果見表1。S-誘抗素的標準偏差為0.86，變異系數為0.88%。

表1 98%S-誘抗素原藥精密度測定結果

準確度測定方法為：稱取空白樣品1.0 g，分別加入質量濃度為2.0、50.0、100.0 mg/L 3個添加水平的S-誘抗素標準溶液，每個添加水平下每個樣品平行測定2次，結果見表2。S-誘抗素平均添加回收率為100.08%～100.40%。

表2 98%S-誘抗素原藥準確度測定結果

2.3 藻類生長抑制試驗水樣檢測結果

在98%S-誘抗素原藥對藻類生長抑制試驗期間，設計質量濃度為2、3、4.5、6.75、10.125、15.188 mg/L時，S-誘抗素72 h實測濃度與設計濃度比值分別為91.35%～94.68%，結果見表3。S-誘抗素72 h的實測濃度均高于設計濃度的80%，因此該設計濃度可用于計算藻類生長抑制EC50值。

表3 藻類生長抑制試驗各處理藥液濃度測量數據

2.4 溞類急性活動抑制試驗水樣檢測結果

在98%S-誘抗素原藥對溞類急性活動抑制試驗期間，當設計質量濃度為8、12、18、27、40.5、60.75 mg/L時，S-誘抗素48 h實測濃度與設計濃度比值分別為92.77%～95.42%，結果見表4。供試物48 h實測濃度均高于設計濃度的80%，因此此設計濃度可用于計算溞類急性活動抑制EC50值。

2.5 斑馬魚急性毒性試驗水樣檢測結果

在98%S-誘抗素原藥對斑馬魚急性毒性試驗期間，設計質量濃度為100 mg/L時，0 h、96 h實測濃度與設計濃度比值分別為98.646%和96.673%，結果見表5。供試物96 h的實測濃度均高于設計濃度的80%，因此可用設計濃度為100 mg/L為計算溞類急性活動抑制LC50值。

表4 溞類急性活動抑制試驗各處理藥液濃度試驗數據

表5 斑馬魚急性毒性試驗各處理藥液濃度實驗數據

3 結論

本研究采用高效液相色譜法，以甲醇＋水（體積比為60∶40）為流動相，使用Pgrandsil-STC-C18液相色譜柱分離，紫外檢測器測定S-誘抗素質量濃度。試驗結果表明，本分析方法準確度、靈敏度良好。

在98%S-誘抗素原藥對藻類生長抑制試驗、溞類急性活動抑制試驗和魚類急性毒性試驗期間，結果表明供試物的實測濃度均不低于設計濃度的80%，可用設計濃度來計算藻類生長抑制EC50值、溞類急性活動抑制EC50值和魚類急性毒性LC50值。