二步酶解法制備魚鱗明膠抗氧化肽及其抗氧化活性研究

盧素珍 - 涂宗財,2,3 -,2,3 王 輝 祝 鄒

(1. 南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2. 江西師范大學國家淡水魚加工技術研發專業中心，江西 南昌 330022；3. 江西省淡水魚高值化利用工程技術研究中心，江西 南昌 330022)

中國是淡水魚養殖大國，2013～2017年，淡水魚養殖年產量為2 481～2 815萬t，淡水魚養殖產量逐年增加，而淡水產品加工總量只有362～408萬t，加工利用率僅為13.77%～16.06%[1-5]。另一方面，魚類加工的副產物主要包括魚頭、皮、鰭、鱗、卵和內臟等，約占加工魚類生物量的60%以上，這些副產物少部分被加工成低廉的飼料，大部分被直接丟棄造成環境污染和資源浪費，一定程度上影響了漁業和水產養殖業的經濟效益[6-7]。

活性氧自由基在生物體信號傳導過程中發揮重要作用，但當機體內的自由基過剩時則可能導致細胞損傷，誘發糖尿病、冠心病和癌癥等諸多疾病[8]。抗氧化肽可以提高抗氧化酶的活力從而降低活性氧自由基的水平，保護細胞抵御自由基介導的氧化應激損傷[9]。酶解工藝是抗氧化肽制備的關鍵，主要的酶解方法包括單酶法[10-11]和多酶分步酶解法[12-13]。如Zhao等[14]和Zhang等[15]分別通過單酶法制備敏魚魚鰾和海蜇頭抗氧化肽，Yarnpakdee等[12]和Yang等[8]分別通過雙酶二步酶解法制備羅非魚和帶魚魚肉抗氧化肽。與單酶解法相比，雙酶二步酶解法具有酶切位點多、酶解程度高，更易制備高抗氧化活性肽的優勢[8]。

因此，本研究擬以草魚魚鱗為原料，通過雙酶二步酶解法制備草魚魚鱗明膠抗氧化肽，為草魚魚鱗的提值增效和提高淡水魚產品加工利用率提供參考。并通過響應面試驗對二步酶解工藝進行優化，為草魚魚鱗明膠抗氧化肽的制備提供一種高效、省時、經濟的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

草魚魚鱗：南昌市鄱陽湖農牧漁業發展股份有限公司；

堿性蛋白酶：8.68×107U/g，諾維信生物技術有限公司；

胰蛋白酶(4.07×107U/g)、風味蛋白酶(1.83×105U/g)、木瓜蛋白酶(4.27×106U/g)、胃蛋白酶(4.92×106U/g)、抑肽酶：索萊寶生物科技有限公司；

乙腈、三氟乙酸、細胞色素C、L-還原型谷胱甘肽和羥脯氨酸：色譜純，索萊寶生物科技有限公司；

其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀：D-2000 HSM型，日本Hitachi公司；

酶標儀：synergH1型，美國伯騰儀器有限公司；

電子天平：ML104/02型，梅特勒—托利儀器(上海)有限公司；

pH計：DZG-6021P型，梅特勒—托利儀器(上海)有限公司；

冷凍干燥機：LGJ-1D-80型，北京亞泰科隆儀器技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 魚鱗明膠抗氧化肽的制備 根據文獻[16]的方法制備草魚魚鱗明膠。第一步酶解的方法參考文獻[17]并修改如下：稱取10 g草魚魚鱗明膠于100 mL蒸餾水，按酶與底物的比例為1∶100(g/g)加入堿性蛋白酶，酶解條件為pH 8.0、溫度50 ℃、時間4 h，酶解結束后煮沸10 min，冷卻后，4 000 r/min離心10 min，上清液凍干。稱取10 g凍干的堿性蛋白酶水解物按表1進行第二步酶解，酶解結束后煮沸滅酶10 min，離心取上清液。一部分上清液用于測定抗氧化活性、氨基態氮含量，另一部分凍干保存待用。所使用酶的活力按SB/T 10317—1999進行測定。

表1 第二步酶解條件

1.2.2 水解度的測定 采用甲醛滴定法測定水解液中氨基氮的含量[18]，參照GB 5009.5—2006測定原料中總氮含量，按式(1)計算水解度。

(1)

式中：

h——水解度，%；

m1——氨基態氮含量，mg/mL；

m2——總氮含量，mg/mL。

1.2.3 分子量的測定 根據GB 31645—2018修改如下：XBridge BEH 125A SEC(7.8 mm×300 mm, 3.5 μm)；流動相為乙腈—水—三氟乙酸(體積比40∶60∶0.05)，流速0.5 mL/min，上樣量10 μL，柱溫30 ℃，L-2400型紫外檢測器，檢測波長220 nm。以細胞色素C(12 384 Da)、抑肽酶(6 512 Da)、L-還原型谷胱甘肽(613 Da)和羥脯氨酸(131 Da)為標準品繪制標準曲線。平均分子量按式(2)計算：

logMw=-0.228 39t+6.539 04，

(2)

式中：

Mw——分子量，Da；

t——保留時間，min。

1.2.4 抗氧化能力的測定

(1) DPPH·清除能力：根據文獻[19]修改如下，600 μL 1 mg/mL的樣品與等體積0.039 mg/mL DPPH甲醇溶液混合均勻，避光反應20 min，517 nm處測吸光值A1。600 μL DPPH與等體積蒸餾水反應為控制組A0，600 μL樣品與等體積甲醇反應為對照組A2。相同濃度的二叔丁基羥基甲酚(BHT)作為陽性對照。DPPH·清除率按式(3)計算。

(3)

式中：

S——自由基清除率，%；

A1——樣品組吸光值；

A2——對照組吸光值；

A0——控制組吸光值。

(2) ·OH清除能力:根據文獻[20]修改如下，500 μL 1 mg/mL的樣品與150 μL 2.22 mg/mL FeSO4、125 μL 0.68 mg/mL H2O2、500 μL 0.41 mg/mL水楊酸(乙醇溶解)，37 ℃水浴反應20 min，離心1 min。上清液于510 nm處測吸光值A1。500 μL蒸餾水代替樣品的吸光值為A0，125 μL甲醇代替H2O2的吸光值為A2。相同濃度的BHT作為陽性對照?！H清除率根據式(3)計算。

(4) Fe2+螯合能力：根據文獻[22]修改如下， 800 μL 1 mg/mL的樣品與10 μL 0.25 mg/mL FeCl2、20 μL 2.46 mg/mL 菲洛嗪混合反應10 min，562 nm處測吸光值A1。800 μL蒸餾水代替樣品為控制組A0，10 μL蒸餾水代替FeCl2為對照組A2。相同濃度的BHT為陽性對照。Fe2+螯合率按式(4)計算。

(4)

式中:

C——亞鐵離子螯合率，%；

A1——樣品組吸光值；

A2——對照組吸光值；

A0——控制組吸光值。

1.2.5 響應面試驗設計 根據前期單因素試驗結果，以Fe2+螯合率為指標，進行溫度、時間和pH的三因素三水平Box-Behnken響應面試驗優化。

1.2.6 數據處理 采用SPSS 17.0和Design-Expert 8.0.5 進行數據處理及統計分析，選取LSD和Duncan用于顯著性分析(P<0.05)，用Origin 2018作圖。試驗數據為3個平行樣品的平均值。

2 結果與分析

2.1 二步酶解對水解度的影響

水解度通常用于檢測蛋白質肽鍵斷裂釋放出短鏈多肽的程度，水解度越大肽鍵斷裂釋放出的短鏈多肽越多[23-24]。二步酶解對水解度的影響如圖1所示，在堿性蛋白酶水解的基礎上，加入胰蛋白酶、風味蛋白酶、木瓜蛋白和胃蛋白酶二步酶解后水解度分別提高了15.52%，17.99%，13.62%，6.68%，堿性蛋白酶—風味蛋白酶水解物的水解度最大為27.63%，表明二步酶解可以顯著提高酶解物的水解度。這一結果與Sun等[24]和Sinthusamran等[25]的結果一致。螺旋藻蛋白通過堿性蛋白酶酶解水解度為25.47%，而通過堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶二步酶解水解度為32.90%，水解度增大了7.43%[24]。凡納濱對蝦通過自源酶(胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和彈性蛋白酶)進行自體分解，水解度為35.31%，通過0.5%和1.0%堿性蛋白酶進行二步酶解后，水解度分別為42.28%和44.93%，水解度分別增大了6.97%和9.62%[25]。

2.2 二步酶解對分子量的影響

如圖2所示，堿性蛋白酶水解物以及4種酶的二步酶解物的體積排阻色譜圖中主要的峰均為4個，表明水解物由4組不同分子量范圍的組分組成。

如表2所示，與堿性蛋白酶水解物相比，胰蛋白酶、風味蛋白酶和木瓜蛋白酶二步酶解物中分子量較大的組分I、II和III的相對含量減小，而分子量較小的組分IV的相對含量增大，表明胰蛋白酶、風味蛋白酶和木瓜蛋白酶能夠將堿性蛋白酶水解物中大分子量的肽段進一步水解成分子量更小的肽段?？赡苁且鹊鞍酌浮L味蛋白酶和木瓜蛋白酶在二步酶解過程中引入了新的酶切位點，以胰蛋白酶為例，其酶切位點是賴氨酸和精氨酸，在二步酶解過程中胰蛋白酶可以將含有賴氨酸和精氨酸的大分子量多肽進一步酶解成分子量更小的多肽。

2.3 二步酶解對抗氧化能力的影響

表2 水解物中各組分的分子量及其相對含量?

? A堿性蛋白酶，B 堿性蛋白酶+胰蛋白酶，C 堿性蛋白酶+風味蛋白酶，D堿性蛋白酶+木瓜蛋白酶，E堿性蛋白酶+胃蛋白酶。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.4 響應面試驗設計方案及結果

為進一步優化二步酶解條件，達到降低能耗、縮短時間、提高酶解效率的目的，結合項目組前期研究，以堿性蛋白酶—胰蛋白酶水解物的Fe2+螯合率為考察指標，對胰蛋白酶第二步酶解的pH、溫度和時間進行了三因素三水平的Box-Behnken響應面試驗優化，試驗設計及結果分別見表3、4。

由表5可知，因素A、C對堿性蛋白酶—胰蛋白酶水解物的Fe2+螯合率影響顯著(P<0.01)，因素B不顯著(P>0.05)，交互相AB、AC和BC影響不顯著(P>0.05)；由F值可知，3個因素對堿性蛋白酶—胰蛋白酶水解物的Fe2+螯合率的影響依次是：時間>pH>溫度。模型的P值為0.002 1，達到極顯著水平(P<0.01)，失擬項F值為0.033，不顯著(P>0.05)，表明模型擬合良好。以pH、溫度、時間為變量，堿性蛋白酶—胰蛋白酶水解物的Fe2+

表3 Box-Behnken設計試驗因素與水平

表4試驗設計方案與結果

Table4Experimentaldesignschemewithexperimentalresultsforresponsesurfaceanalysis

試驗號ABCFe2+螯合率/%1-1-1045.762-10158.3630-1-146.904-10-140.805-11047.58610-135.19700060.7780-1156.53900054.981010144.01111-1036.841211034.601300055.001401163.901501-148.20

表5Fe2+螯合率為響應值的回歸模型方差分析?

Table5Analysisofvariance(ANOVA)ofregressionequationwithFe2+chelatingabilityasresponse

來源平方和自由度均方F值P值模型1 197.049133.0020.040.002 1??A219.001219.0032.990.002 2??B 8.5218.521.280.308 7C 334.201334.2050.350.000 9??AB4.1314.130.620.466 0AC19.08119.082.880.150 7BC9.2619.261.400.290 7A2577.641577.6487.030.000 2??B238.19138.195.750.061 7C20.1210.120.0180.898 3殘差33.1956.64失擬項10.9233.640.330.811 2純誤差22.26211.13合計1 230.2314

螯合率為響應值，進行回歸分析，得到回歸方程：

Y1=-852.013+203.249A+3.904B+0.789C-0.102AB-0.109AC+7.608×10-3BC-12.508A2-0.032B2+4.505×10-4C2。

(5)

通過響應模型優化得到堿性蛋白酶—胰蛋白酶水解物的Fe2+螯合率最大值為65.20%，此時第二步酶解的條件為pH 7.75、溫度53.19 ℃、時間50 min。

考慮到實際操作的方便性，調整第二步酶解的條件為底物濃度100 mg/mL、pH 7.8、溫度53 ℃、時間50 min，預測值的Fe2+螯合率是65.08%，重復3次驗證實驗后計算平均值，得到實際Fe2+螯合率為65.72%，與預測值相差0.64%。由此可知，模型比較可靠。未優化的第二步酶解的條件：底物濃度50 mg/mL、pH 8.0、溫度50 ℃、時間4 h，堿性蛋白酶—胰蛋白酶水解物的Fe2+螯合率為63.26%。經過優化后，堿性蛋白酶—胰蛋白酶水解物的Fe2+螯合率提高了2.46%，底物濃度增大了1倍，酶解時間縮短了190 min。

2.5 酶解物的抗氧化活性

3 結論