大孔樹脂純化苜蓿葉蛋白肽的工藝優化

許英一 - 吳紅艷 - 王 宇 王 彪

(1. 齊齊哈爾大學食品與生物工程學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2. 黑龍江省農科院畜牧獸醫分院，黑龍江 齊齊哈爾 161005)

紫花苜蓿(medicagosativa)是一種多年生的優良豆科牧草，有“牧草之王”的美稱，是國內外主要栽培的牧草之一[1-3]。苜蓿葉蛋白的營養價值高，粗蛋白含量高達50%～60%，并且氨基酸組成配比合理[4]，據文獻[5]報道許多氨基酸及其衍生物具有抗氧化能力，如半胱氨酸、組氨酸、色氨酸、賴氨酸、精氨酸等，可作為優良的蛋白原添加于飲料、焙烤等食品中。但由于苜蓿葉蛋白溶解性等功能性質較差，限制了其在食品中的應用。研究[6-8]表明，蛋白肽具有抗氧化、降血壓、調節血清中血脂水平、抗癌、提高免疫等功能。謝正軍等[9]通過提取、酶解和超濾從苜蓿葉蛋白中分離得到了相對分子質量不同的可溶性苜蓿葉蛋白及其酶解粗肽和精制肽，比較了其抗氧化活性，發現苜蓿葉蛋白幾乎沒有抗氧化活性，而酶解后的粗肽以及超濾后的精制肽均表現出較強的抗氧化活性，而且精制肽的抗氧化活性強于粗肽。因此，將酶解后的粗肽純化后更適合應用于食品工業。

近年來，大孔樹脂被廣泛應用于多酚、生物堿、二氫槲皮素、皂苷等活性成分的分離純化[10-11]。馬寒冰等[12]進行了不同型號的大孔吸附樹脂的靜態吸附和解吸試驗，確定DA201-C型大孔吸附樹脂對大豆多肽的吸附性能及脫鹽效果最佳，多肽含量提高了70.35%、糖和鹽含量分別降低了70.80%和93.93%。李華等[13]采用超濾與大孔樹脂吸附、乙醇分級洗脫分離純化抗氧化黑豆肽，確定DA201-C型樹脂對抗氧化肽的分離效果優于其他3 種樹脂，體積分數為75% 乙醇洗脫組分具有相對最強的ORAC 值。綜上，前人對豆科肽類的純化研究較多，純化效果也較好。但對苜蓿葉蛋白肽的制備及純化研究較少。謝正軍[14]研究了苜蓿葉蛋白酶解物超濾和脫鹽工藝，采用先超濾再經大孔吸附樹脂脫鹽后，苜蓿葉蛋白酶解物的蛋白質含量僅提高了1.73%。為簡化純化步驟，本研究擬采用不經超濾僅用大孔吸附樹脂脫鹽工藝純化苜蓿葉蛋白肽，并對苜蓿葉蛋白肽的純化工藝進行優化，為植物葉蛋白肽類化合物進一步分離純化提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

紫花苜蓿：黑龍江省農科院畜牧獸醫分院；

大孔樹脂：DA201-C型，鄭州華溢科技新材料股份有限公司；

大孔樹脂：D101、HPD 500、HPD 600型，河北滄州寶恩化工有限公司；

大孔樹脂：AB-8、X-5型，南開大學化工廠；

其他化學試劑：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

高速藥物粉碎機：WK-600A型，青州市精誠機械有限公司；

分光光度計：722N型，上海精密科學儀器有限公司；

高速冷凍離心機：日立CR21G型，天美(中國)科學儀器有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：HHS21-4型，上海躍進醫療器械廠；

恒流泵：HL-2S型，上海青浦滬西儀器廠；

電腦全自動部份收集器：DBS-100型，上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 苜蓿葉蛋白肽的酶法水解制備工藝

苜蓿葉蛋白粉→配制一定底物濃度(g/mL)的水溶液→預熱(50 ℃，30 min)→調節pH 8.5→加入一定量的堿性蛋白酶Alcalase 2.4 L→置于恒溫水浴振蕩器(120 r/min，50 ℃)酶解2 h→滅酶(沸水浴10 min)→離心(4 000 r/min，20 min)→上清液即為苜蓿葉蛋白肽

1.2.2 大孔吸附樹脂預處理 用2倍樹脂床體積(2 BV)5%的HCl，以2 BV/h的流速過柱浸泡2 h，用水洗至中性，再用2 BV 2%的NaOH溶液以同樣流速過柱浸泡2 h，再用水洗至中性抽濾，備用。不同大孔吸附樹脂的物理結構參數見表1。

1.2.3 大孔吸附樹脂篩選 準確稱取已處理好的6種不同類型大孔吸附樹脂各10.000 0 g，分別置于100 mL具塞錐形瓶中，各加入質量濃度5 mg/mL的苜蓿葉蛋白肽溶液30 mL，將錐形瓶塞好塞子后置于恒溫水浴振蕩器中振蕩10 h(25 ℃，150 r/min)，待吸附完全后抽濾，測定被吸附后的苜蓿葉蛋白肽液質量濃度。吸附完全的6種樹脂用100 mL蒸餾水沖洗至流出液呈中性，加入30 mL體積分數為75%的乙醇，在25 ℃，150 r/min振蕩10 h進行解吸，過濾，測定濾液中苜蓿肽的質量濃度，按式(1)、(2)計算不同型號的大孔吸附樹脂對苜蓿葉蛋白肽溶液的吸附率及解吸率。

表1 不同大孔樹脂的物理結構參數

(1)

(2)

式中：

C0——吸附前溶液中肽的濃度，mg/mL；

C1——吸附后溶液中肽的濃度，mg/mL；

W2——解吸率，%；

C2——解吸液中肽的濃度，mg/mL；

V1——解吸液的體積，mL；

V——吸附液的體積，mL。

1.2.4 大孔吸附樹脂(DA201-C)靜態吸附—解吸試驗

對于下一代圖書館服務平臺（LSP），國內的湖北三新、超星、CALIS（Folio）、西安文淵等也在涉足。

(1) 靜態吸附與解吸試驗：于100 mL具塞錐形瓶中加入已處理好的大孔吸附樹脂10.000 0 g，再加入30 mL質量濃度為5 mg/mL的苜蓿葉蛋白肽液，置于恒溫水浴振蕩器中振蕩10 h(25 ℃，150 r/min)，分別測定1，2，3，4，5，6，7，8，9，10 h被吸附后的酶解液濃度，按式(1)計算吸附率。繪制靜態吸附曲線。

將充分吸附苜蓿葉蛋白肽的大孔樹脂置于100 mL錐形瓶中，加入體積分數為75%的乙醇30 mL，同樣在25 ℃，150 r/min振蕩10 h進行解吸，分別測定1，2，3，4，5，6，7，8，9，10 h解吸液中的肽濃度。按式(2)計算解吸率。繪制靜態解吸曲線。

(2) 酶解液濃度對吸附效果的影響：準確稱取預處理過的大孔吸附樹脂10.000 0 g于100 mL錐形瓶中，分別加入2.5，5.0，7.5，10.0 mg/mL的苜蓿葉蛋白肽液30 mL，在25 ℃，150 r/min的恒溫水浴振蕩器中振蕩10 h，待充分吸附后過濾，測定濾液中肽液的質量濃度。計算吸附率。

(3) 乙醇體積分數對解吸效果的影響：對充分吸附了苜蓿葉蛋白肽溶液的大孔吸附樹脂抽濾，分別用體積分數為25%，50%，75%，100%的乙醇解吸，收集10 h后的解吸液，過濾，測定濾液中肽液的質量濃度。計算解吸率。

1.2.5 大孔吸附樹脂(DA201-C)動態吸附—解吸試驗

(1) 上樣流速對DA201-C型大孔吸附樹脂吸附性能的影響：配制質量濃度為10 mg/mL的苜蓿葉蛋白肽溶液，分別以0.5，1.0，2.5 mL/min的流速流經層析柱，每10 mL 收集1管，測每次流出液中苜蓿葉蛋白肽的濃度，計算樹脂的吸附率。

(2) 上樣濃度對DA201-C型大孔吸附樹脂吸附性能的影響：分別配制質量濃度為5，10，15 mg/mL的苜蓿葉蛋白肽溶液，以0.5 mL/min的流速流經層析柱，每10 mL 收集1管，測每次流出液中苜蓿葉蛋白肽的濃度，計算樹脂的吸附率。

(3) 洗脫流速對DA201-C型大孔吸附樹脂解吸性能的影響：將濃度為10 mg/mL的苜蓿葉蛋白肽溶液，以0.5 mL/min 的流速進行動態吸附。結束后抽濾，然后用體積分數為75%的乙醇溶液分別以0.5，1.0，2.5 mL/min的流速過柱解吸，每10 mL收集1管解吸液，測每次流出液中苜蓿葉蛋白肽的濃度，計算樹脂的解吸率。

(4) 洗脫體積對DA201-C型大孔吸附樹脂解吸性能的影響：將濃度10 mg/mL的苜蓿肽，以0.5 mL/min的流速進行動態吸附。結束后抽濾，用體積分數為75%的乙醇溶液以0.5 mL/min的洗脫流速過柱解吸，每10 mL收集1管解吸液，測每次流出液中苜蓿葉蛋白肽的濃度，計算樹脂的解吸率。

1.2.6 DA201-C型大孔吸附樹脂對苜蓿葉蛋白肽的純化效果 測定經DA201-C型大孔吸附樹脂純化前后的苜蓿葉蛋白肽的含量、糖含量、鹽含量。

1.2.7 總糖含量測定 蒽酮比色法[15]。

1.2.8 蛋白含量測定 Folin酚法[16]。

1.3 數據處理

采用SPSS 19.0軟件進行統計分析，所有試驗均重復3次，各試驗數據均以平均值和標準誤差表示，采用Duncan 法比較因素水平間的差異性(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 大孔吸附樹脂篩選

由圖1可知，非極性樹脂對苜蓿肽的吸附和解吸能力較強，與陳飛平[17]40研究的結果相符，也說明苜蓿肽的疏水性較高。6種大孔樹脂的吸附率和解吸率有顯著性差異(P<0.05)，DA201-C型的吸附率達到87.00%。采用體積分數75%乙醇溶液對吸附后的DA201-C型大孔樹脂進行洗脫，解吸率亦最高為89.37%，DA201-C型大孔吸附樹脂的吸附率和解吸率明顯高于其他類型，因此本試驗篩選DA201-C型大孔吸附樹脂為純化苜蓿葉蛋白肽的最適大孔樹脂。在6種大孔樹脂中，由于DA201-C型大孔樹脂為非極性樹脂，比表面積最大，且平均孔徑相對較小，因此對疏水性多肽有較強的吸附性，而對分子量較大的蛋白吸附力差，可以達到分離純化小分子苜蓿葉蛋白肽的目的[17]40。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.2 大孔吸附樹脂(DA201-C)靜態吸附—解吸試驗

2.2.1 靜態吸附—解吸動力學曲線 由圖2可知，苜蓿葉蛋白肽吸附率和解吸率分別在前1 h和前3 h迅速增加，之后增加緩慢，基本達到平衡，屬于快速平衡型。因此，DA201-C型大孔樹脂對苜蓿葉蛋白肽具有良好的吸附和解吸性能。

圖2 DA201-C 型大孔樹脂靜態吸附—解吸動力學曲線

Figure 2 The kinetic curve of static adsorption and desorption of DA201-C macroporous resins

2.2.2 酶解液質量濃度對樹脂靜態吸附效果的影響 由圖3可知，隨苜蓿肽溶液濃度的增加，大孔樹脂的吸附率先上升后下降，在苜蓿肽溶液濃度為7.5 mg/mL時最大，為88.95%。這與鄧慧玲[18]的研究結果相符，可能是酶解液濃度達到一定時，肽分子數量增多，在擴散過程中相互碰撞，反而阻礙了向大孔樹脂擴散的速度，導致吸附率下降。因此，酶解液的質量濃度控制在7.5 mg/mL。

2.2.3 乙醇體積分數對樹脂靜態解吸效果的影響 由圖4 可知，隨著乙醇體積分數的增加，大孔樹脂的解吸率先上升后下降。解吸效果在乙醇體積分數75%最好。可能是高濃度乙醇會使蛋白質和一些肽類物質沉淀而解吸困難。

圖3 酶解液質量濃度對吸附性能的影響

Figure 3 Influence of mass concentration of enzymatic hydrolysate on the adsorption efficiency

圖4 乙醇體積分數對解吸效果的影響

2.3 大孔吸附樹脂(DA201-C)動態吸附—解吸試驗

2.3.1 上樣流速對DA201-C型大孔吸附樹脂吸附性能的影響 由圖5可知，隨著上樣流速的增大，吸附率降低；上樣流速為0.5 mL/min時，吸附率最大。可能是大孔樹脂的吸附需要一個接觸和擴散的過程，如果流速過快，酶解液來不及擴散到樹脂的內表面就提早泄露而造成樣品流失[17]44，吸附率就會下降。

圖5 上樣流速對吸附性能的影響

2.3.2 上樣濃度對DA201-C型大孔吸附樹脂吸附性能的影響 由圖6所示，在動態時各酶解液濃度均隨著流出液體積的增加使吸附率降低，但相比較濃度為10 mg/mL吸附率降低的慢。由于某一型號的大孔吸附樹脂吸附量一定，若酶解液濃度過高超出了吸附量，會造成水解物的損失，而較低的樣品濃度會造成吸附率下降。因此確定10 mg/mL 為最佳上樣濃度。

圖6 上樣濃度對吸附性能的影響

2.3.3 洗脫流速對DA201-C型大孔吸附樹脂解吸性能的影響 由圖7可知，隨著洗脫體積增大，3種洗脫流速的大孔樹脂解吸率均先迅速增加到最高點而后降低直至平穩，且均在洗脫體積10 mL達最高點。而當洗脫流速為0.5 mL/min時，解吸率最高，且解吸率從最高點下降至平穩趨勢看，當洗脫流速為0.5 mL/min時，下降速度快，即最先達到洗脫平衡。因此本試驗選擇0.5 mL/min時作為最佳的苜蓿葉蛋白肽的洗脫流速。

2.3.4 洗脫體積對DA201-C型大孔吸附樹脂解吸性能的影響 由圖8可知，隨著洗脫體積增加，解吸率先升到最高點后降低，當洗脫體積>50 mL后，解吸率較低，表明大部分苜蓿葉蛋白肽已被洗脫下來了。而在200 mL時，解吸率趨于平緩，解吸率達到6.4%，表明流出液中水解物含量已經很少，因此將75%乙醇洗脫劑體積定為200 mL。

圖7 洗脫流速對解吸性能的影響

圖8 洗脫體積對解吸性能的影響

2.3.5 DA201-C型大孔吸附樹脂對苜蓿葉蛋白肽的純化效果 根據優化過程的結果分析，采用動態吸附。確定在上樣濃度為10 mg/mL，上樣流速為0.5 mL/min，采用DA201-C型大孔吸附樹脂對苜蓿葉蛋白水解物進行動態吸附，再以200 mL的75%乙醇溶液作為洗脫劑，0.5 mL/min的洗脫流速對吸附后的大孔樹脂進行解吸，收集洗脫液經旋轉蒸發和冷凍干燥，得到純化后的苜蓿葉蛋白肽，測定吸附前后的酶解物成分含量，其成分分析見表2。

表2苜蓿葉蛋白酶解液純化前后成分分析?

Table2Compositionanalysisofalfalfaleafproteasehydrolysatebeforeandafterpurification%

? 同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

由表2可看出，純化后的苜蓿葉蛋白酶解液中苜蓿葉蛋白肽含量由60.45%提高到了88.83%，純度較之前提高了46.95%。而糖含量由2.87%降低至0.52%，純度降低了81.88%。無機鹽等雜質的含量由36.68%降低至10.65%，純度降低了70.97%，苜蓿葉蛋白酶解液營養成分在純化前后有顯著性差異(P<0.05)，說明DA201-C型大孔吸附樹脂能去除苜蓿葉蛋白酶解液中大部分無機鹽及糖類。

3 結論

本試驗首先對6種大孔吸附樹脂進行篩選，確定DA201-C型大孔吸附樹脂為苜蓿葉蛋白肽純化的最適材料。通過靜態吸附—解吸和動態吸附—解吸試驗得到該工藝的最佳純化條件為上樣流速0.5 mL/min，上樣濃度10 mg/mL，采用75%乙醇溶液解吸，洗脫流速0.5 mL/min，洗脫體積200 mL，在該條件下苜蓿葉蛋白肽含量較純化前明顯提高，說明優化的工藝參數可行。本試驗探討了采用大孔吸附樹脂純化苜蓿葉蛋白肽的優化工藝，若將其應用于食品或者保健品，還需要進一步動物試驗和臨床試驗，研究苜蓿葉蛋白肽體內、體外抗氧化活性及抗氧化作用機理，為工業化生產高活性成分的苜蓿葉蛋白肽提供新方法。