非小細(xì)胞肺癌液體活檢技術(shù)研究進(jìn)展

吳亮，山順林

作者單位：1蚌埠醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，安徽 蚌埠 233000；2解放軍82醫(yī)院腫瘤中心，江蘇 淮安 223001

原發(fā)性肺癌是人類常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐年上升，其中 80%～85%為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)[1]。我國惡性腫瘤發(fā)病率及病死率占第1位的均是肺癌[2]。具有發(fā)病率高、發(fā)病機(jī)制復(fù)雜、早期難以發(fā)現(xiàn)，治療效果不佳等特點(diǎn)。腫瘤標(biāo)志物有助于早期診斷肺癌，對早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療有重要作用。根據(jù)數(shù)據(jù)顯示，在初診時，57%的病人已出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，因此發(fā)現(xiàn)新的有價值的生物學(xué)標(biāo)志物檢測方法對于早期診斷肺癌，預(yù)測疾病發(fā)展，快速評估療效顯得十分重要[3]。

穿刺活檢標(biāo)本雖然能明確有無腫瘤及其類型，但是有創(chuàng)傷性，而且由于肺癌的位置和大小、腫瘤組織的異質(zhì)性、活檢組織的滯后性，有不易反映腫瘤整體狀態(tài)，不易隨時監(jiān)測，多次活檢依從性差等缺點(diǎn)。正是存在這些缺點(diǎn),液體活檢技術(shù)在腫瘤的早期監(jiān)測顯示出明顯的技術(shù)優(yōu)勢，被MIT Technology Review(麻省理工科技評論)雜志公布為2015年度十大突破技術(shù)的榜單，液體活檢位列其中，成為當(dāng)下研究熱門領(lǐng)域[4]。液體活檢是一種非侵入性的新型診斷技術(shù)，具有無創(chuàng)傷性，標(biāo)本容易獲得，可以反映腫瘤整體狀態(tài)，實(shí)現(xiàn)實(shí)時監(jiān)測的優(yōu)點(diǎn)，有助于腫瘤微轉(zhuǎn)移的早期發(fā)現(xiàn)和預(yù)后評估，在治療監(jiān)測，個體化治療發(fā)揮重要價值。基于精準(zhǔn)醫(yī)療已經(jīng)成為腫瘤診療過程的熱點(diǎn)，液體活檢是指從體液中獲得來源組織的生物標(biāo)志物，并通過對所得標(biāo)志物分析來反映其來源組織相關(guān)信息[5]。液體活檢項(xiàng)目包括循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)、循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA),外泌體(Exosomes),小核糖核酸miRNA等，其中CTCs與ctDNA發(fā)展最為迅猛。目前液體活檢主要應(yīng)用領(lǐng)域是腫瘤的血液檢測，即利用血液提示腫瘤發(fā)展進(jìn)程及抗藥性等信息，指導(dǎo)個體化精準(zhǔn)治療。

目前，CTCs、ctDNA和外泌體是現(xiàn)在最主流的液體活檢技術(shù)，表1對這三種技術(shù)做了簡單的歸納。

表1 液體活檢的分類

從技術(shù)角度上，隨著新一代的測序技術(shù)，ctDNA的檢測變得最為容易，也是液體活檢領(lǐng)域發(fā)展最快的分支，外泌體是本身理化性質(zhì)的原因，分離難度最大，CTCs因?yàn)榘麄€細(xì)胞的基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組是液體活檢領(lǐng)域臨床研究最為深入。

1 CTCs

1.1 CTCs作為潛在標(biāo)志物的研究進(jìn)展CTC在1869年被澳大利亞病理學(xué)家John Ashworth發(fā)現(xiàn)，是指在實(shí)體腫瘤發(fā)生過程中，有少量的細(xì)胞從原生腫瘤脫離進(jìn)入血液，隨血液循環(huán)到達(dá)新的定植器官，繼而形成新的轉(zhuǎn)移灶[6]。1960年科學(xué)家發(fā)現(xiàn)多個CTC聚集在一起的CTC簇。而隨著1994年Cellsearch系統(tǒng)的研發(fā)成功，大量的臨床實(shí)驗(yàn)展現(xiàn)了CTC在癌癥預(yù)后復(fù)發(fā)效用上的應(yīng)用[7]。

目前CTCs是罕見的可以預(yù)測多種腫瘤預(yù)后的細(xì)胞，這些循環(huán)細(xì)胞通過不同技術(shù)進(jìn)行檢測，其分析被稱為對病人的實(shí)時“液體活檢”。CTCs具有廣闊前景，在技術(shù)上仍然具有很大的挑戰(zhàn)性，尤其是關(guān)于CTC富集和分析技術(shù)，已先后出現(xiàn)膜過濾法、免疫熒光染色、RT-PCR等，這些技術(shù)的不斷革新提高了從海量血細(xì)胞中獲取CTC的準(zhǔn)確度和對后續(xù)分析提供支持，也是這項(xiàng)技術(shù)的臨床應(yīng)用成為可能。Dorsey等[8]研究中指出在成功檢測CTCs數(shù)量的NSCLC病人中，放療后病人血清CTCs數(shù)量減少和腫塊的大小減小相一致，表明CTCs可以作為放療療效的評測指標(biāo)。很多研究表明，很多腫瘤直徑即使在2～4 mm的情況下已經(jīng)有腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移進(jìn)入血液循環(huán)，從這個角度，CTCs檢測技術(shù)對于腫瘤的早期診斷具有重要意義。研究通過Cellsearch技術(shù)檢測早期未發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤病人(根據(jù)腫瘤的類型)CTC細(xì)胞的比率非常低，利用同樣的技術(shù)，Ilie等[9]對長期吸煙的慢性阻塞性肺疾病病人進(jìn)行CTC細(xì)胞測定，定期復(fù)查最終診斷為肺癌的病人發(fā)現(xiàn)CTCs。CTCs對于腫瘤的早期診斷方面有至關(guān)重要的作用，在Fiorelli等[10]的研究中,CTCs計數(shù)>25可以幫助從良性病變病人中區(qū)分肺癌的異常肺部成像。

1.2 CTCs臨床應(yīng)用進(jìn)展臨床分期是病人制定相關(guān)治療方案的依據(jù)。目前基于影像學(xué)檢測結(jié)果和通過腫瘤的病灶侵犯深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況來判斷病人的臨床分期，不能準(zhǔn)確判斷腫瘤病灶血液微轉(zhuǎn)移情況對病人治療及預(yù)后的影響。液體活檢技術(shù)檢測CTCs可以很好地彌補(bǔ)這一缺陷，對病人的臨床分期做出有效的評估。Krebs等[11]研究101例未經(jīng)任何治療Ⅳ期NSCLC病人，發(fā)現(xiàn)治療前CTC計數(shù)水平與腫瘤分期具有顯著相關(guān)。Nicolazzo等[12]對24例Ⅳ期NSCLC參與PD-1/PD-L1抑制劑治療的病人，發(fā)現(xiàn)CTCs及其PD-L1的表達(dá)與病人的不良反應(yīng)結(jié)果相關(guān)。說明PD-L1陽性CTCs可能成為抗PD-1定向治療的預(yù)測性腫瘤標(biāo)志物。

1.3 CTCs的臨床局限性雖然CTCs技術(shù)已經(jīng)表現(xiàn)出很強(qiáng)的診斷和預(yù)測腫瘤治療有效性的的作用,CTCs同時具有局限性，CellSearch和其他的技術(shù)使用上皮組織標(biāo)志物并不能發(fā)現(xiàn)所有的CTCs，因此依賴單細(xì)胞測序技術(shù)的發(fā)展，同時腫瘤細(xì)胞具有異質(zhì)性，CTCs細(xì)胞并不能完全代表實(shí)體腫瘤，這些問題都需要在臨床上亟待解決[13]。

2 ctDNA

2.1 ctDNA作為潛在標(biāo)志物的研究進(jìn)展ctDNA是指腫瘤細(xì)胞DNA經(jīng)脫落或者當(dāng)細(xì)胞凋亡后釋放進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，源于腫瘤細(xì)胞的雙鏈DNA,主要存在血液，滑膜腔積液，腦脊液等體液中，外周血游離DNA的大小約為160～190 bp，其長度大約為50 nm。循環(huán)DNA的表現(xiàn)應(yīng)該更具有特異性，隨著基因測序的飛速發(fā)展，目前，已能在血液中對其進(jìn)行檢測并計數(shù)。它的發(fā)現(xiàn)追溯到循環(huán)游離DNA(cfDNA)，cfDNA是由體細(xì)胞釋放入外周血循環(huán)后發(fā)生降解的內(nèi)源性DNA。ctDNA可以通過多種方式進(jìn)入血液中，比如：分泌、吞噬作用以及凋亡壞死[14]。Qiu等[15]研究發(fā)現(xiàn)ctDNA提供了一種微創(chuàng)和可行的方法檢測EGFR突變的NSCLC(NSCLC)。ctDNA的分析將是NSCLC個體化治療一個重要組成部分。Nie等[16]指出，基因突變、基因甲基化等均可在NSCLC病人ctDNA中發(fā)現(xiàn)，ctDNA可以用來檢測NSCLC，同時對于腫瘤的異質(zhì)性，ctDNA檢測腫瘤變異比CTCs有更高的敏感性和特異性。Marchetti等[17]從37例非小細(xì)胞癌病人中抽取血液樣本利用CellSearch系統(tǒng)結(jié)合二代測序技術(shù)(NGS)進(jìn)行研究，檢測到ctDNA中EGFR基因突變和對應(yīng)腫瘤組織檢測結(jié)果31例，提示液體活檢結(jié)果為病人EGFR基因突變產(chǎn)生并為病人提供個體化治療提供重要的參考依據(jù)。

2.2 ctDNA臨床應(yīng)用進(jìn)展很多科學(xué)研究表明ctDNA可以準(zhǔn)確預(yù)測病人的預(yù)后，美國約翰霍普金斯大學(xué)發(fā)明BEAMing擴(kuò)增法，大大提高ctDNA的檢測敏感性。通過將循環(huán)DNA與磁珠結(jié)合進(jìn)行計數(shù)，可以實(shí)現(xiàn)萬分之一的檢測靈敏度。此外數(shù)字化PCR技術(shù)也逐漸應(yīng)用于ctDNA基因檢測。數(shù)字PCR技術(shù)是一種新型的高靈敏性的核酸片段分析技術(shù)。Chen等[18]收集了58例早期NSCLC病人的配對血液和組織標(biāo)本，采用靶向測序技術(shù)檢測配對的腫瘤血漿ctDNA標(biāo)本的基因突變狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血漿檢測ctDNA突變狀態(tài)，與組織標(biāo)本具有較高的一致性，且比不同腫瘤標(biāo)志物具有更高的敏感性。表明ctDNA可以作為判斷腫瘤的預(yù)測因子。Rosell等[19]通過ctDNA分析180例晚期NSCLC病人的EGFR和KRAS的突變狀態(tài)，其中120例病人診斷時時分析ctDNA，而60例病人在出現(xiàn)對EGFR-TKIs耐藥性時分析了ctDNA。結(jié)果顯示對于發(fā)生轉(zhuǎn)移的病人而言，ctDNA分析是檢測EGFR和KRAS突變的有效方式。最新研究表明，ctDNA中腫瘤特異性突變和CTC計數(shù)相比，在判斷預(yù)后ctDNA方面展現(xiàn)非常明顯的優(yōu)越性。

2.3 ctDNA的臨床局限性不同病人不同時間測定外周血中ctDNA水平差異很大，受清除速度、血容量、腫瘤的分期分級等因素影響較大。此外基于現(xiàn)代的檢測技術(shù)digital PCR，標(biāo)記擴(kuò)增深度測序技術(shù)、分光光度法提高靈敏性,血液標(biāo)本中ctDNA量少，與腫瘤組織相比，可靠性穩(wěn)定性尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

3 Exosomes

3.1 Exosomes作為潛在標(biāo)志物的研究進(jìn)展Exosomes 來源廣泛，淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、肥大細(xì)胞及上皮樣細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等都可以分泌外泌體。這些細(xì)胞向胞外分泌的囊泡類小體，直徑約為40～100 nm，具有典型的脂質(zhì)雙分子層膜結(jié)構(gòu)，其攜帶有母細(xì)胞多種蛋白質(zhì)、脂類、DNA和RNA等重要信息，在細(xì)胞和細(xì)胞間的物質(zhì)交換和信息傳遞起到重要作用[20]。外泌體含有大量的蛋白質(zhì)，主要分為兩類：一類是外泌體固定蛋白，另一類是與細(xì)胞來源和組織類型相關(guān)性的特異性蛋白。此外，外泌體含有大量的遺傳信息mRNA和miRNA，對外泌體研究最多的是具有功能活性的miRNA成分。最近的研究表明，這些外泌體可以作為標(biāo)志物，來檢測疾病的進(jìn)展，甚至在病人出現(xiàn)臨床癥狀前做出腫瘤診斷、預(yù)后判斷、療效評估。腫瘤來源的Exosomes促進(jìn)腫瘤的生長，轉(zhuǎn)移和耐藥[22]。目前對于外泌體的分離提純方法包括高速離心法，密度梯度離心法，色譜法，超濾膜過濾離心法等[23]。NSCLC病人的Exosomes中包含的腫瘤相關(guān)蛋白有EGFR、KARS、claudins、RAB家族蛋白等。Alos等[24]對8例化療前的NSCLC病人的外泌體進(jìn)行電泳分析，發(fā)現(xiàn)NSCLC，發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)特異性高表達(dá)的蛋白條帶，還發(fā)現(xiàn)NSCLC腫瘤組織中也存在該蛋白高表達(dá)，提示高表達(dá)的特異性蛋白條帶可能來源原發(fā)腫瘤組織，可作為NSCLC潛在的腫瘤標(biāo)志物。

3.2 Exosomes的生物學(xué)功能肺癌發(fā)生和發(fā)展是一個多步驟的過程，涉及分子基因水平的變化，肺癌的發(fā)病過程仍有很多未解之處。NSCLC通過與腫瘤微環(huán)境相互作用介導(dǎo)腫瘤的增殖和侵襲。Al-Nedawi等[25]發(fā)現(xiàn)NSCLC 外泌體可將突變的EGFR 轉(zhuǎn)移到腫瘤相關(guān)的血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)分泌，從而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖。Wang等[26]研究表明，NSCLC 外泌體中的TGF-β和IF-10 也參與調(diào)控細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)移，其高水平表達(dá)可促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。Rahman 等[27]通過將具有侵襲性和不具有侵襲性的肺癌細(xì)胞外泌體分別作用于受體細(xì)胞進(jìn)行對比研究，發(fā)現(xiàn)高度侵襲性肺癌外泌體可誘導(dǎo)受體細(xì)胞表達(dá)與腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的波形蛋白，并可能通過波形蛋白來驅(qū)動受體細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而獲得侵襲和遷移能力。另外，NSCLC 外泌體中的miRNA 也廣泛參與NSCLC 侵襲-轉(zhuǎn)移過程中的調(diào)控[28]。

3.3 Exosomes的臨床局限性NSCLC外泌體的研究有重要的臨床意義，但是很多問題需要解決，外泌體的miRNA的表達(dá)受到很多因素影響，特異性和靈敏性不高，目前尚無標(biāo)準(zhǔn)的提純外泌體的方法，在分離和純化外泌體的過程還有很多問題需要進(jìn)一步解決，腫瘤組織和外泌體的miRNA存在一定差異性[29]。在臨床上不能廣泛的應(yīng)用。

4 展望

早期檢測是癌癥研究和治療的關(guān)鍵，液體活檢是一項(xiàng)富有挑戰(zhàn)的新技術(shù)，在腫瘤的精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)中扮演越來越重要的角色，隨著檢測標(biāo)準(zhǔn)化的日益發(fā)展，檢測靈敏度的提高，以及新的生物標(biāo)志物的問世，液體活檢將成為最具發(fā)展?jié)摿Φ哪[瘤無創(chuàng)診斷和實(shí)時療效檢測手段，臨床應(yīng)用價值極其顯著。大量研究進(jìn)一步證實(shí)，液體活檢技術(shù)檢測在腫瘤細(xì)胞中數(shù)量與腫瘤發(fā)生、療效、轉(zhuǎn)移和預(yù)后有著密切的關(guān)系，通過外周血對腫瘤細(xì)胞的檢測，有助于腫瘤的早期診斷，療效的快速評估，個體化治療，預(yù)后判斷和腫瘤復(fù)發(fā)的監(jiān)測。

隨著腫瘤基因組分型系統(tǒng)和精準(zhǔn)治療的臨床廣泛應(yīng)用和推廣，本文側(cè)重描寫了當(dāng)前熱門的CTCs，ctDNA，miRNA，外泌體技術(shù)在NSCLC中的研究進(jìn)展，目前液體活檢行業(yè)仍處于早期階段，真正進(jìn)入臨床但仍有很多問題亟待解決，著力開發(fā)高特異性和靈敏性的檢測技術(shù)是進(jìn)一步臨床的前提，建立檢測標(biāo)準(zhǔn)，還需得到臨床實(shí)踐的認(rèn)可，在檢測技術(shù)不斷創(chuàng)新的同時，相信液體活檢技術(shù)會成為未來精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)趨勢。