鱗狀上皮細胞癌抗原聯合人乳頭瘤病毒DNA檢測對非典型鱗狀上皮細胞的診斷意義

楊飛翔，江俊青，羅克鍇，趙錚

作者單位：1湖北醫藥學院附屬東風醫院檢驗科，湖北 十堰 442000；2湖北醫藥學院藥護學院，湖北 十堰 442000

宮頸癌(Cervical Cancer)是臨床最常見的婦科惡性腫瘤之一，嚴重威脅著女性的生命健康[1-2]。目前，宮頸細胞學檢查(TCT)可較好的診斷出高級別宮頸細胞瘤變，但對于宮頸細胞學檢查為無法明確診斷意義的非典型鱗狀上皮細胞(atypical squamous cell of undermined significance,ASCUS)的病人，由于其病理結果具有多樣性，包括宮頸上皮細胞良性病變和不同程度宮頸上皮細胞瘤變(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)，因此，臨床上對ASCUS的處理一直是宮頸疾病診治中的難點及爭論的焦點[3-4]。衛生部關于子宮頸癌診斷指南中指出宮頸癌中70%～80%癌癥組織學分類屬于鱗狀細胞癌，血清中SCC水平是檢測腺癌的一種重要腫瘤標志物，在宮頸癌發生和發展進程中，由宮頸癌細胞所分泌或產生并釋放至血液，能反映宮頸癌發生發展過程，其對于宮頸癌的輔助診斷和預后效果評價具有較高的特異性，但敏感性較差，而HPV DNA對于宮頸癌早期診斷具有較高敏感性，但特異性較差，因此，本研究旨在探討二者的聯合篩查，提高其對宮頸癌早期診斷的敏感性或特異性，減少漏診率或降低誤診率，研究HPV DNA、血清SCC單一或聯合在ASCUSS病人分流管理中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集湖北醫藥學院附屬東風醫院2014年1月至2017年1月宮頸液基細胞學顯示為ASCUSS，并同時檢測SCC、HPV DNA及宮頸組織病理學分析的病人175例，同時，選取同期體檢健康女性50例為對照組，HPV和SCC均陰性。所有入選人員均無子宮切除術和宮頸手術史，年齡范圍為21～70歲，目前未懷孕，無骨盆放射治療史，無宮頸癌診斷史的已婚婦女。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求，病人或近親屬對研究方案簽署知情同意書。

1.2 主要儀器與試劑美國雅培Abbott I2000全自動化學發光儀、液基細胞學制片分析系統、潮州凱普HPV基因分型檢測試劑盒、美國Applied Biosystems公司PCR儀、北京白洋臺式血清離心機等。

1.3 研究方法

1.3.1血清學檢測 采用促凝采血管，空腹采取肘靜脈血3～5 mL，4 000 r/min離心5 min分離血清。SCC含量測定采用電化學發光法，采用美國雅培Abbcott I2000全自動化學發光儀進行檢測。SCC參考范圍：0～1.5 ng/mL，SCC>1.5 ng/mL即為陽性。

1.3.2液基細胞學檢測 病人均處于非月經期，采集前1 d無性生活，且檢測前3 d無陰道用藥，標本采集由專業婦科醫生進行，采用專用取樣刷于宮頸管鱗柱交界可疑病變處，將宮頸移行帶區脫落細胞洗入試劑配套的專用保存液中及時常溫送檢。同時采集兩份，一份做細胞學檢測，一份做HPV DNA檢測。液基細胞學檢測采用2001版國際癌癥協會推薦的TBS系統分級標準進行分級，由兩名病理醫師對結果進行判讀。

1.3.3HPV DNA分析 采用潮州凱普公司的PCR+膜雜交法檢測HPV DNA，其中高危HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68共15種，低危HPV6、11、42、43、44、81共6種，共21種。操作步驟按照試劑說明書進行。PCR反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性20 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環，最后72 ℃延伸5 min。雜交檢測結果陽性點為清晰可見的藍紫色原點，根據膜條HPV分布圖，判斷陽性點的HPV分型。

1.3.4宮頸病理組織活檢 在婦科醫生的指導下進行陰道鏡檢查，對可疑部位進行多點取材，如無異常則區3，6，9，12點處，組織標本用甲醛固定后及時送病理科檢測。組織病理診斷由高年資病理醫師做出最后診斷，組織病理學結果：正常或慢性炎癥、CIN Ⅰ～Ⅲ級，宮頸癌(浸潤性鱗狀細胞癌、腺癌、其他宮頸細胞癌)。組織學陽性：高級別宮頸上皮細胞瘤變，即≥宮頸上皮內瘤變CINⅡ者為陽性，組織學陰性：正常、慢性炎癥、尖銳濕疣、低級別宮頸上皮細胞瘤變(CINⅠ)。

2 結果

2.1 不同年齡段ASCUSS病人病理檢查結果分析以宮頸組織病理學為標準，175例ASCUSS病人中，共檢出炎癥或正常133例，CIN Ⅰ 28例，CINⅡ/Ⅲ 12例，宮頸鱗狀細胞癌2例，21～30歲占總例數的20.57%(36/175)，其中13.89%檢出CINⅡ及以上病變；>30～40歲占22.29%(39/175)，其中12.82%檢出CINⅡ及以上病變；>40～50歲占34.85(61/175)，其中6.56%檢出CINⅡ及以上病變。CINⅡ及以上病理結果檢出主要集中在21～50歲之間，年齡>50歲，未檢出CINⅡ及以上病變；21～50歲之間，不同年齡段之間CINⅡ及以上檢出率均差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2 ASCUS病人HPV、SCC與病理結果分析宮頸癌組病人血清SCC水平明顯其他各組，差異有統計學意義(均P<0.05)；CINⅡ/Ⅲ組病人血清SCC水平明顯高于健康組、正常或炎癥組、CINⅠ組(均P<0.05)，差異有統計學意義。見表2。

表2 ASCUSS不同病理結果中血清SCC含量分析

注：a為與健康組、正常或炎癥組比較，P<0.05；b為與CINⅠ比較，P<0.05；c為與CINⅡ/Ⅲ組比較，P<0.05

2.3 ASCUS病人HPV檢測、SCC含量與組織病理活檢結果175例ASCUS病人中，HPV陽性75例，占42.86%(75/175)，HPV陽性組與HPV陰性組對于CINⅡ及以上的檢出率分別為16.0%(12/75)和2.0%(2/100)，差異有統計學意義(χ2=9.590，P=0.002)。HPV在正常或炎癥組、CINⅠ組、CINⅡ/Ⅲ組、宮頸癌組中組織學陽性檢出率分別為33.83%(45/133)、64.29%(18/28)、83.33%(10/12)、100.0%，隨著宮頸細胞瘤變程度的加重，HPV陽性率逐漸增加。而ASCUS病人中，血清SCC水平大于1.5 ng/mL有16例，占9.14%，SCC>1.5 ng/mL在ASCUS病人中對于CINⅡ及以上的檢出率為37.5%(6/16)，顯著高于SCC≤1.5 ng/mL病理檢出率5.03%(8/159)，差異有統計學意義(χ2=16.644，P=0.000)；SCC陽性在正常或炎癥組、CINⅠ組、CINⅡ/Ⅲ組、宮頸癌組中檢出率分別為4.51%(6/133)、14.29%(4/28)、33.330%(4/12)、100.00%，隨著宮頸細胞瘤變程度增加，SCC陽性率逐漸增加。

以宮頸病理組織活檢為標準，高級別宮頸上皮細胞瘤變即≥宮頸上皮內瘤變CINⅡ者為陽性，HPV DNA和血清SCC水平測定對于預測CINⅡ及以上病理結果的靈敏度、特異度、陰性預測值及陽性預測值分別為85.71%和42.86%、60.87%和93.79%、98.00%和94.97%、16.00%和37.50%。為提高其靈敏性，降低漏診率，采取并聯試驗，即SCC和HPV中任一為陽性即判定為陽性，二者聯合檢測應用于預測高級別宮頸癌病變的靈敏性、特異度、陰性預測值及陽性預測值分別為92.86%、57.76%、98.94%、16.05%。見表3。

表3 175例ASCUS病人HPV檢測、血清SCC含量與組織病理活檢結果分析比較/例

2.4 ASCUS病人主要HPV感染亞型及病理檢查結果分析HPV感染陽性組中，主要HPV感染亞型有16、18、52、58、33，其分別對應CINⅡ及以上患病率為24.14%(7/29)、10.00%(1/10)、10.00%(1/10)、10.00%(1/10)、28.57%(2/7)。正常或炎癥組、CINⅠ組、CINⅡ組中分別有3例、1例、1例多重HPV亞型感染，CINⅡ中一例混合感染HPV33和53型。CINⅡ及以上病人14例，HPV陽性檢出率為85.71%(12/14)，其中，HPV16、18、33、52、58在高級別宮頸組織瘤變病人中分別占50.00%(7/14)、7.14%(1/14)、14.29%(2/14)、7.14%(1/14)、7.14%(1/14)。在正常或低級別瘤變組中，有低危型HPV感染，而在高級別宮頸細胞瘤變中未見低危HPV亞型感染的發生。見表4。

表4 ASCUS病人主要HPV感染分型及病理檢查結果比較/例

3 討論

宮頸癌是威脅發展中國家女性健康的主要衛生問題之一，我國每年約有15萬宮頸癌新發病例[5]。宮頸癌的發生起源于宮頸組織細胞異常增生，而早期宮頸癌無明顯臨床指征，因此容易造成漏診或誤診。臨床常用的宮頸細胞學檢查在宮頸癌早期篩查中可有效篩查出大部分高級別CIN，但是其對于低級別CIN靈敏性較差，特別是宮頸細胞學ASCUS狀態，因為該狀態可能是潛在惡性改變或是增生活躍的良性改變，因此，對于ASCUS分流管理對于宮頸癌的漏診誤診具有很重要的意義。本調查資料顯示，175例ASCUSS病人中，共檢出高級別宮頸上皮細胞瘤變病例14例，其中檢出宮頸癌病人2例，因此，如果對ASCUS病人簡單地進行隨診處理，無疑會漏診一部分癌前病變甚至是宮頸癌病人。

女性生殖道HPV持續感染是高級別 CIN及宮頸癌發生的必然條件[6-7]，CIN病人中80%～90%伴有 HPV 感染，通常認為年輕婦女(<30歲)的HPV感染是一過性的，大部分HPV 感染會自然消退，僅5%～10%發展為持續感染[8]。HPV的檢出率隨著宮頸病變的嚴重程度增加而增加，在本研究中175例ASCUSS病人中，HPV檢出率為42.86%，HPV DNA陽性對于CINⅡ及以上的檢出率顯著高于HPV DNA陰性病例檢出率，且隨著CIN級別的增加，HPV陽性率越高，因此，對于ASCUS病人，行HPV DNA篩查可有效的分流ASCUS病人。但在高級別宮頸上皮細胞瘤變病例中，也有HPV陰性者，這可能與我院檢測試劑盒檢測范圍的局限性，也可能與病人取材有關。研究發現，HPV感染率與感染亞型分布存在一定地域差異，魏英等研究湖北十堰地區[9]，徐萬洲等[10]研究湖北省地區女性宮頸人乳頭狀瘤病毒感染與亞型分布，發現湖北地區HPV感染亞型主要為16、18、52、58型，而本研究中HPV 感染主要亞型是16、18、52、58、33，說明我省HPV感染亞型主要是16、18、52、58型。

在宮頸癌早期篩查中，HPV DNA檢測具有較高的靈敏度，但也存在一定局限性，如特異性較差[11]，假陽性、假陰性等問題，在本研究中，若以宮頸病理組織活檢為標準，高級別宮頸上皮細胞瘤變，即≥宮頸上皮內瘤變CINⅡ者為陽性，HPV DNA單一檢測對于預測CINⅡ及以上病理結果的靈敏度達到85.7%，但特異性僅60.9%。血清腫瘤標志物SCC水平可反映腺癌發生發展的狀態，在惡性腫瘤的輔助診斷中起著重要作用，特別是反映晚期宮頸癌狀態及宮頸癌預后效果評價[12]，其無創、簡單、易于病人接受。然而，單一標志檢查雖有較高特異性但其也有局限性，因此，臨床上很少使用血清SCC水平來診斷早期宮頸癌。在本研究中，血清SCC水平測定對于預測CINⅡ及以上病理結果的靈敏度僅有42.86%，特異度超過90%，而二者聯合檢測應用于預測高級別宮頸癌病變的靈敏性、特異度、陰性預測值及陽性預測值分別為92.86%、57.76%、98.94%、16.05%。二者聯合檢測，可以有效提高對于高級別宮頸細胞瘤變檢出的靈敏性和陰性預測值，提高ASCUSS病人對于高級別CIN篩查的靈敏性和準確性，減少ASCUS病人中高級別瘤變的漏診，也可以減少不必要的陰道鏡檢查或宮頸活檢等有創操作。

在本研究中雖然發現HPV DNA檢測聯合SCC測定，可以有效提高對于高級別宮頸細胞瘤變檢出的靈敏性和陰性預測值，提高ASCUSS病人對于高級別CIN篩查的靈敏性和準確性，但聯合檢測相對于HPV DNA在靈敏性方面僅提高7%，提高幅度較小，同時在研究ASCUS不同病理狀態SCC水平含量時，CIN Ⅰ組數據不成正態分布，造成這些問題的原因可能是我院為職工醫院，收集標本多年齡主要集中在21～50歲之間，可能造成數據的偏態分布，同時對于ASCUS狀態的診治臨床學界尚處于爭議階段，病人對于宮頸細胞學檢出ASCUS狀態，大多采取保守治療，如定期復查宮頸細胞學檢查或HPV DNA檢測，而取同時行HPV DNA、血清SCC含量檢測、宮頸組織活檢的病人少之又少，因此，造成收集病例數量偏少，而沒有充分發揮二者聯合檢測提高靈敏性的效果。雖然二者聯合檢測可提高靈敏度，但特異度仍較低，因此，研究靈敏性、特異性更高的宮頸細胞分子標志物如HPV E6/E7 mRNA，HPV蛋白，p16，Ki67，TOP2A/MCM2等細胞因子以及DNA甲基化對于宮頸癌早起診治具有重要的意義。

總之，單獨HPV DNA或血清SCC檢測對于宮頸癌早期病變診斷和分流具有重要作用，但各自都有其局限性，兩者聯合檢測可有效提高宮頸癌高級別病變的靈敏性，減少宮頸癌高級別病變的漏診和不必要的活檢，能在早期有效分流管理ASCUS人群。