家蠶轉基因技術及其應用

吳　駿　羅　漫　郝志華　謝玉凱　黃曉冰　馬維苑　田　鈴

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家蠶轉基因技術及其應用

吳駿羅漫郝志華謝玉凱黃曉冰馬維苑田鈴

（華南農業大學動物科學學院 廣東廣州 510642）

自家蠶基因組測序完成以來，家蠶的相關研究進入了后基因組時代，也使得家蠶的轉基因技術得以迅速的發展。文章介紹了家蠶中轉基因的技術及其發展現狀，為今后的基因編輯技術、轉基因家蠶研究以及生物反應器等應用提供了借鑒與參考。

家蠶；轉基因；基因編輯；生物反應器

自20 世紀80年代開始，在世界范圍內掀起了動物轉基因技術的研究熱潮。1984年，我國開始了轉基因動物的研究，并取得了一系列成果，如：含人—珠蛋白基因的轉基因小鼠的構建[1]、含乙型肝炎表面抗原基因的轉基因兔的獲得，以及我國首例轉基因克隆牛的誕生[2]，這些都標志著我國在轉基因領域有了一定的研究進展。

家蠶（）為鱗翅目絹絲昆蟲，是我國重要的特種經濟動物，主要以桑葉為食，分泌的蠶絲是一種天然的紡織原料。蠶絲產業曾在我國出口創匯和脫貧致富中發揮著重要的作用，但是隨著我國經濟結構的調整以及社會需求的轉變，傳統蠶桑產業已經發展到瓶頸期，如何進行傳統產業改革、利用家蠶進行多元化開發已成為當今家蠶研究領域的一個熱點與難點。

2004年我國科學家率先完成了家蠶基因組的測序工作，使得我國家蠶遺傳或是分子生物學的研究開始走在世界的前列。同時，隨著基因組學相關技術的不斷深入與發展，尤其是基因組精準編輯技術和轉基因家蠶技術的不斷推進，使其在家蠶科學研究中的應用也越來越廣泛。以轉基因技術為工具，對家蠶的功能基因進行遺傳操作，進而嘗試表達目的蛋白或者改變家蠶經濟性狀已經成為了研究熱點。本文綜述了近年來適用于家蠶轉基因的技術和轉基因應用成果，以期為今后的相關研究提供參考。

1 家蠶轉基因技術

1.1 家蠶轉基因技術操作的方法

轉基因技術指的是將外源DNA片段利用基因工程技術導入特定的受體中，使之與受體的基因進行重組，并穩定表達的一種實驗技術。在家蠶中常用的操作方法有：顯微注射法、精子介導法、基因槍法等。

1.1.1 顯微注射法

顯微注射技術是一種通過顯微注射操作儀將外源物質、細胞核或細胞注入到受體中的微操作技術，應用廣泛且效果良好。Tamura[3]等于1990年建立家蠶顯微注射操作技術，并成功獲得了相應的轉基因家蠶品系。目前，利用顯微注射法進行家蠶轉基因操作已經非常成熟，并有了很多創新，如Sun[4]等構建了兩個轉基因RNAi載體，并利用顯微注射法獲得了具有濃核病抗性的轉基因家蠶品系。但是，該方法對儀器和操作人員的技術有一定的要求，且可能會導致卵體受傷、孵化率低等問題。

1.1.2 精子介導法

精子介導法是一種利用精子能瞬間吸收外源基因的特性，將整合了外源目的基因的載體與精子進行預培養，使部分精子帶上外源基因，在受精時與卵細胞結合，達到基因重組目的的一種方法。具體可分為先注后交法、先交后注法、人工受精法。郭秀洋[5]等、Zhou[6]等都利用該方法成功得到轉基因家蠶，驗證了該方法的可行性。

1.1.3 基因槍導入法

基因槍導入法又被稱為粒子轟擊技術，孟智啟[7]等于1992年首次使用該方法，成功將金屬粒子以550 ～ 600 m/s的轟擊速度沖破卵殼打入卵內，經過檢測大多數卵發育正常，利用該方法一些科學家獲得了表達目的基因的轉基因家蠶品系。

1.1.4 其他方法

除上述幾種常用的方法外，轉基因家蠶的操作方法還包括壓力滲透導入法 (osmoticmethod, OM)[8]、脈沖場電泳法(pulsed-field gel electrophoresis, PFGE)、電穿孔導入法(electroporation)及脂質體轉染法等，都有一定的可行性。

1.2 家蠶轉基因載體

轉基因載體是一類裝載有外源 DNA并且能使其隨自身復制而得到擴增的DNA構造，它可以將外源DNA在一定條件下插入到宿主基因中。轉基因載體包括一些固有的元件，如啟動子、轉座子序列等。在進行轉基因實驗時，除了注意目的基因的導入方法和導入時期外，選擇合適的啟動子和構建合適類型的載體也是影響實驗的關鍵因素。

1.2.1 家蠶轉基因所用載體的啟動子

啟動子是一段能識別、結合RNA聚合酶并使自身活化、啟動轉錄的一段DNA序列。在轉家蠶基因的研究中，適合的啟動子是決定外源基因能否成功表達的重要因素之一。目前常見的家蠶轉基因所用載體的啟動子有肌動蛋白A3啟動子[9]、人工啟動子3Xp3[10]、熱激蛋白啟動子[11]、抗菌肽啟動子、家蠶絲心蛋白啟動子[12]和家蠶核型多角體病毒早期即刻蛋白基因啟動子[13]等。

1.2.2 家蠶轉基因所用載體類型

1.2.2.1 基于轉座子的載體

piggyBac轉座子是一種DNA轉座子，由于存在可攜帶較長的基因片段、整合效率較高等優點，它在家蠶的轉基因技術中得到了廣泛應用。在2000年，Tamura[14]等首次將piggyBac轉座子應用于家蠶中，其將家蠶細胞質肌動蛋白（BmA3）啟動子和綠色熒光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）基因連在含piggyBac的末端重復序列的質粒上，與含有piggyBac轉座酶基因的輔助質粒共同注射于胚胎前期蠶卵中，雖然成功獲得轉基因品系，但是表達效果并不理想。針對BmA3啟動子效率較低的問題，Horn和Wimmer將piggyBac載體進行改進，之后Thomas[15]用改進的piggyBac載體注射蠶卵，并取得較好的表達效果。

minos轉座子是一種可在家蠶胚胎和營養細胞中轉移DNA的轉座元件[16]，Shimizu[17]、Uchino[18]等先后將其應用于家蠶轉基因研究中。Mosl元件也可應用于家蠶轉基因研究中，Wang[19]等利用其成功將外源基因導入體外培養的家蠶細胞（Bm5）中，由于minos轉座子和Mosl元件都具有插入位點不確定性的缺點，因此后來都被piggyBac轉座子所取代[20]。

1.2.2.2 基于病毒的載體

研究發現，桿狀病毒和逆轉錄病毒也可以充當載體，將目的基因高效地整合到家蠶基因組中，是一種良好的家蠶轉基因工具。桿狀病毒主要以家蠶核型多角體病毒 （BmNPV）和苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒（AcMNPV）為主，其原理主要是將目的基因插入到病毒的特定位點，利用病毒的特性，使外源基因整合到家蠶基因組中。相關的研究有，張峰[21]等利用家蠶細胞質肌動蛋白基因（A3）啟動子和NPV病毒即刻早期蛋白IE啟動子成功在家蠶細胞中表達了GFP基因。

逆轉錄病毒的應用起步于20世紀90年代末，Nikolaev[22]等、Chan等先后利用逆轉錄病毒的LTR序列分別介導外源基因整合到家蠶、牛的基因組中；后來，河本夏雄等利用反轉錄病毒的LTR序列將GFP基因導入家蠶體細胞，并對G0代幼蟲進行了RCR檢驗，發現了病毒載體成功侵入胚胎細胞中，逆轉錄出了cDNA。

1.2.2.3 基因打靶載體

隨著相關技術的提升，基因打靶技術在轉基因家蠶研究中得到一定的應用，即利用同源重組原理，將外源基因定向地融合進靶細胞基因組中的某個位點。自20世紀80年代興起后，逐漸被科學家用來對某一確定位點的基因進行定點突變，以達到修飾基因的目的。相較于較常用的piggyBac轉座子載體，它可以有效的克服轉座子隨機整合的問題。1999年，Yamao[23 ]等將GFP基因與絲素輕鏈第7外顯子融合，利用AcMNPV載體，將GFP基因打靶進蠶卵母細胞基因組絲素輕鏈中，并得以表達。2002年，朱成鋼[24]等將基因與家蠶絲心蛋白輕鏈基因融合，構成一種新型的轉基因家蠶打靶載體pBacF53 TG。

1.2.2.4 其他基因載體

據相關報道，YAC載體也可應用于家蠶轉基因中。李振剛[25]等利用YAC載體將天蠶絲基因整合于家蠶基因組中，獲得綠繭家蠶品系。

2 基因編輯技術在家蠶轉基因中的應用

基因編輯技術是指通過人工核酸酶對動物特定的內源性基因進行目地性的修飾, 如敲除、敲入、定點突變等, 并結合體細胞核移植與胚胎移植等技術手段, 以此獲得被修飾編碼的個體。基因編輯技術最早適用于基因的定點突變和敲除，其目的主要是在未引入外源基因的情況下對生物體進行基因組上的精準操作。但是隨著技術的發展，通過基因編輯工具，也可以實現準確和簡便的基因敲入，所以也可以把基因敲入編輯的生物認為是轉基因生物。

目前，基因編輯技術主要發展了3代：分別是鋅脂核酸內切酶(zinc finger endonucleases, ZFNs)、類轉錄激活因子效應物核酸內切酶(transcription activatorlike effector endonucleases, TALENs) 和CRISPR/Cas9 [clustered regulatory interspaced short palindromic repeats/Cas9(CRISPR associated 9) ]技術[26]。其中 TALEN技術和CRISPR/Cas9 技術目前應用最為廣泛，兩者各有優點，TALEN技術具有高度的特異性，而CRISPR/Cas9 技術的操作更簡便。

表1　 基于人工核酸內切酶的基因組靶向編輯技術在家蠶轉基因中的應用

截止2018年部分數據

3 家蠶轉基因技術的應用

在眾多科學家的不懈努力情況下，家蠶轉基因技術開始應用于各個領域，主要在基礎研究領域、家蠶遺傳育種和生物反應器方面的應用。

3.1 在基礎研究領域的應用（功能基因組領域）

轉基因技術可以應用于家蠶功能基因的研究，探究家蠶基因的作用和家蠶生長發育的調控機制。例如，Uhliová[31]等人利用piggyBac轉座子介導的轉基因技術成功地研究了核受體基因的功能。結果顯示，的表達在家蠶每次蛻皮過程中受蛻皮激素的控制。在研究家蠶幼蟲體壁半透明基因基因的過程中，Fujii[32]等利用轉基因技術發現，該基因突變后的家蠶與油蠶幼蟲表皮中尿酸轉化成尿酸顆粒的過程受到抑制。除此之外，Tan[33]、Hongjiu[34]等也通過轉基因技術結合GAL4/ USA雙元轉基因系統進行了一系列研究。

在不同品種的轉基因家蠶中，外源基因的表達效果可能存在差異，所以將家蠶基因的啟動子或者增強子序列與基因形成融合基因，再以此獲得轉基因家蠶，則可通過基因的表達情況，來顯示目的基因的表達調控，確定有利于目的基因表達的家蠶品系。Kurihara[35]等人就通過相關實驗發現絲膠缺乏家蠶在轉基因方面的應用潛力。

3.2 在家蠶遺傳育種領域的應用

隨著現代社會的高速發展，傳統品系的家蠶已經難以滿足多元化的市場需要。相對于傳統的家蠶育種方式，利用轉基因技術進行家蠶育種，將特定的功能基因導入家蠶中，使之表達特定的性狀，這樣的品種往往能表現出傳統家蠶品系沒有的特征。目前已經有很多科學家從事這方面工作，并取得了一些進展。

3.2.1 抗性品種培育

自古以來，蠶病一直就是困擾蠶桑產業的一大難題。目前，主要的蠶病有病毒病、細菌病、真菌病等。其中，BmNPV病毒病具有易傳染、致病性強的特點，是蠶桑產業中最容易造成經濟損失的病原之一，也是蠶桑科學研究的主要對象。在2004年，Isobe[36]等人首次利用轉基因技術，將RNA干擾BmNPV的片段在家蠶中過表達，使家蠶對BmNPV有了一定的抵抗力，這為培育家蠶抗病品種提供了新的思路。隨后，Kanginakudru[37]等人通過干擾BmNPV的基因，發現得到的轉基因家蠶抗BmNPV感染力有了明顯的提升。在此基礎上，蔣亮[38]等科學家也對此做了一系列后續研究，取得了突破性的進展。

3.2.2 蠶絲品質改良

蠶絲主要以絲素和絲膠為主，還含有蠟、碳水化合物、色素、灰份和天然雜質等，是一種優質的蛋白纖維[39]，但蠶絲也存在不抗皺、不耐磨、產量不足等缺點。2011年，馬俐[40]等利用GAL4/UAS雙元轉換系統將促癌基因在家蠶體內過量表達，大大提高了蠶絲產量，證實了轉基因技術應用的可能性。除此之外，蠶絲的多元化應用也成為了研究重點，如李珍[41]等成功研究出了具有抗菌功能的蠶絲。

3.3 在生物反應器領域的應用

目前家蠶生物反應器主要是利用 piggyBac轉座系統將外源基因在家蠶后部絲腺中表達外源蛋白，形成家蠶絲腺生物反應器（包括絲膠表達系統和絲素表達系統），同時也有研究人員開始進行家蠶脂肪體生物反應器和家蠶血淋巴生物反應器的研究，嘗試以不同特點的家蠶組織表達不同類型的蛋白。

3.3.1 絲腺生物反應器

家蠶絲腺分為前部絲腺、中部絲腺和后部絲腺三個部分，前部絲腺具有導管作用；中部絲腺合成絲膠蛋白，其中主要由、、三個基因編碼；后部絲腺合成絲素蛋白，由 391 kDa的絲素重鏈（Fib-H）、26 KDa的絲素輕鏈(Fib-L)和 30 KDa的 P25 蛋白以6∶6∶1的摩爾比組成并作為蠶絲的基本結構單位[42]。家蠶絲腺具有高效的合成和分泌蛋白的能力，所以大多數科學家都用絲腺來表達外源基因，并取得了不錯的進展。

在2002年，Tomita[43 ]等首次利用 piggyBac轉座子介導的轉基因成功利用家蠶絲腺合成了人 III型前膠原蛋白，經檢驗在蠶繭中發現了該種蛋白。這有力地證明了絲腺作為生物反應器的可能性。Ogawa[44]等在2007年利用piggyBac載體在轉基因家蠶蠶繭的絲膠層中成功表達并分離了重組人血清白蛋白（recombinant human serum albumin, rHSA），并通過研究發現其構象和功能與天然產物相同。后續還有研究表明家蠶的絲腺可以產生小鼠蛋白的單抗[45]、人腦源性神經營養因子[46]、狂犬病毒核蛋白[47]等。

此外，2018年Xu[48]等人還利用 TALEN技術，將家蠶絲素蛋白 H鏈敲除并敲入了蜘蛛絲蛋白基因，成功利用家蠶絲腺高表達了蜘蛛絲蛋白，其方法和意義值得關注和研究，家蠶絲腺作為生物反應器的應用前景巨大，值得進一步研究。

3.3.2 脂肪體生物反應器

脂肪體是昆蟲體內的中間代謝器官，它起到了合成和代謝蛋白質、脂類和糖類、降解有毒物質等重要生理作用[49]。其分泌的蛋白有儲存蛋白、脂蛋白等多種功能蛋白[50]。

部分學者針對這些功能，進行了相關研究。幸俊逸[51 ]等于2010年通過顯微注射技術，將含有主要抗原位點的O型口蹄疫病毒VPI結構蛋白基因為標靶的piggyBac表達載體成功導入家蠶胚胎，獲得轉基因蠶。經驗證，重組口蹄疫 VPI蛋白成功在家蠶脂肪體中表達。劉耀文[52]等也成功通過轉基因技術在家蠶脂肪體表達了重組植酸酶。此外，胡瑩瑩[53]等利用非轉座子系統培育轉基因家蠶，在脂肪體中也得到了有效表達。

3.3.3 血淋巴生物反應器

家蠶血淋巴是家蠶血液與家蠶淋巴液的混合體，是一個開放的系統，內含物豐富，其中就含有大量的蛋白質，它們在家蠶的生長發育過程中起到了重要作用。

Susumu[54]等于1985年利用了桿狀病毒表達載體在家蠶中成功表達了人α-干擾素，活性達到了5×107U/50 μg。隨著研究的深入，重人乳蛋白[55]、P25 蛋白和 Fib-L蛋白[56]、Aβ42 和 CTB-Aβ15 蛋白[57]等都被科學家在家蠶血淋巴中成功地表達。可見，以家蠶血淋巴作為生物反應器的可行性還是非常高的。

4 存在的問題

家蠶作為鱗翅目的模式昆蟲，具有生長周期短、易飼養、繁殖率高、遺傳背景清楚等優點。在進行轉基因研究時，家蠶可以使用人工飼料飼養，且成蟲無法飛行，即可以隔離飼養，這也為轉基因研究帶來了便利，當然存在的問題也很明顯：

（1）轉座子隨機整合：轉座子隨機整合會導致目的基因的表達發生變化，即上調表達、下調表達和異位。這可能會導致轉基因家蠶出現基因層次的負面變化，進而影響整個實驗。目前已經有部分科學家正在研究條件基因打靶技術解決轉座子隨機整合問題[58]。

（2）標記基因保留帶來的隱患：上文中提到，在家蠶轉基因相關操作中，標記一般會保留在轉基因個體的基因組中，但是這會增加轉基因逃逸的可能性，且存在影響目的基因表達的可能性。針對這一問題，位點特異性重組法是目前轉基因動植物中應用比較廣泛的解決方法之一。早在2012年，Long等[59]利用一種基于釀酒酵母（）的FLP/FRT系統的方法，成功定點敲出了標記基因。

（3）外源基因導入后的表達效率：和很多轉基因生物一樣，轉基因家蠶也存在外源基因表達效率不高等問題。尤其是在家蠶生物反應器方面，外源基因的整合率和表達水平較低一直困擾著研究人員。

5 結語和展望

隨著遺傳學和分子生物學技術的發展，越來越多的新技術、新成果將應用于家蠶轉基因領域。伴隨研究的深入，轉基因技術在家蠶育種及資源的品質創新等方面展現了其他技術無法比擬的優勢和潛力，如果我們加以合理的應用，必將為傳統蠶桑產業的升級發展和創新應用帶來新的機遇。

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10.3969/j.issn.2095-1205.2019.04.01

國家自然科學基金項目(31472042，31672368)；華南農業大學創新創業項目(2018年)。

田鈴，教授。

吳駿(1999- )，男，安徽池州人，本科生，研究方向：蠶學。

S882.6

A

2095-1205(2019)04-01-05