艾塞那肽對ApoE—/—小鼠動脈粥樣硬化血清抵抗素的影響

鄧國雄 韋金儒 陳梅香

[摘要] 目的 探討艾塞那肽對蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠動脈粥樣硬化血清抵抗素的影響。 方法 選取高脂喂養(yǎng)的6周齡載脂ApoE-/-雄性小鼠30只，按隨機數(shù)字表法將其分模型組（n = 15）與艾塞那肽組（n = 15），艾塞那肽組給予艾塞那肽1.0 nmol/（kg·d），腹膜下注射，2次/d。選取高脂喂養(yǎng)的同齡、同遺傳的背景野生型C57BL/6J雄性小鼠作對照組（n = 15）。12周后處死并收集血清，并采用自動生化分析儀測定檢測總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、三酰甘油；采用酶聯(lián)免疫吸附法測定抵抗素、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）及白細(xì)胞介素6（IL-6）的含量；主動脈根部作病理切片、蘇木精-伊紅（HE）染色并測量校正的斑塊面積。 結(jié)果 模型組的總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇及三酰甘油水平顯著高于對照組（P < 0.01）；艾塞那肽組的總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇及三酰甘油與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。模型組的抵抗素、TNF-α及IL-6水平與對照組比較，顯著升高（P < 0.01），艾塞那肽組的抵抗素、TNF-α和IL-6含量與模型組比較，顯著降低（P < 0.01）；艾塞那肽組的主動脈粥樣硬化校正斑塊面積明顯小于模型組（P < 0.05）。 結(jié)論 艾塞那肽可有效降低動脈粥樣硬化小鼠的血清抵抗素水平，從而抑制炎性反應(yīng)及動脈粥樣硬化斑塊進展，這可能是胰高血糖素樣肽-1受體激動劑抗動脈粥樣硬化的機制之一。

[關(guān)鍵詞] 艾塞那肽；動脈粥樣硬化；抵抗素；胰高血糖素樣肽-1

[中圖分類號] R587.2 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2019）05（a）-0004-05

Effect of Exenatide on serum resistin in ApoE-/- mice with atherosclerosis

DEND Guoxiong WEI Jinru CHEN Meixiang

Department of Cardiovascular Medicine， the First People′s Hospital of Nanning， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Nanning 530022， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of Exenatide on serum resistin in atherosclerosis of apolipoprotein E knockout （ApoE-/-） mice. Methods Thirty six-week-old ApoE-/- male mice fed with high fat were randomly divided into model group （n = 15） and exenatide group （n = 15）. The exenatide group was given Exenatide 1.0 nmol/（kg·d）， subperitoneal injection twice a day. Male C57BL/6J mice fed with high fat were selected as control group （n = 15）. After 12 weeks， the serum was collected and the levels of total cholesterol， high density lipoprotein cholesterol， low density lipoprotein cholesterol and triglyceride were measured by automatic biochemical analyzer. The contents of resistin， tumor necrosis factor-alpha （TNF-α） and interleukin-6 （IL-6） were determined by enzyme-linked immunosorbent assay. The aortic root was pathologically sliced and stained with hematoxylin-eosin （HE）， and the corrected patch area was measured. Results The levels of total cholesterol， low density lipoprotein cholesterol， high density lipoprotein cholesterol and triglyceride in the model group were significantly higher than those in the control group（P < 0.01）. There was no significant difference in total cholesterol， low density lipoprotein cholesterol， high density lipoprotein cholesterol and triglyceride between the exenatide group and the model group （P > 0.05）； the levels of resistin， TNF-α and IL-6 in the model group were significantly higher than those in the control group （P < 0.01）， while the contents of resistin， TNF-α and IL-6 in the exenatide group were significantly lower than those in the model group （P < 0.01）. The area of corrected atherosclerosis plaque in the exenatide group was significantly smaller than that in the model group （P < 0.05）. Conclusion Exenatide can effectively reduce the level of serum resistin in atherosclerotic mice， thereby inhibiting inflammatory response and atherosclerotic plaque progression， which may be one of the mechanisms of glucagon-like peptide-1 receptor agonists in anti-atherosclerosis.

[Key words] Exenatide； Atherosclerosis； Resistin；Glucagon-like peptide-1

抵抗素是嚙齒類動物脂肪細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子，因其具有抗胰島素的效應(yīng)，最初被認(rèn)為是肥胖與胰島素抵抗之間的主要關(guān)聯(lián)物質(zhì)，故被命名抵抗素[1]。早期研究[2-4]表明，抵抗素主要影響與胰島素作用相關(guān)的葡萄糖穩(wěn)態(tài)，影響脂肪生成；隨著研究進展，發(fā)現(xiàn)其參與炎性反應(yīng)，可導(dǎo)致內(nèi)皮功能失調(diào)、平滑肌細(xì)胞功能障礙、血管增生及血栓形成，加速動脈粥樣硬化進程，增加心血管疾病風(fēng)險[1，5-7]。有研究[8-9]表明，2型糖尿病患者中血清抵抗素水平與微血管病變發(fā)生及心血管病變危險分層成正相關(guān)，這提示抵抗素在糖尿病的動脈粥樣硬化發(fā)病中起著重要作用。艾塞那肽是治療2型糖尿病的一種新藥，起初主要用于控制血糖，隨后有研究[10]發(fā)現(xiàn)其還可通過多種途徑減輕高糖和高脂誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮功能失調(diào)。然而，目前國內(nèi)外有關(guān)艾塞那肽是否通過降低血清抵抗素含量影響動脈粥樣硬化進程的研究未見報道。本研究應(yīng)用艾塞那肽對載脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠動脈粥樣硬化中血清抵抗素含量的影響，探討艾塞那肽抗動脈粥樣硬化的非降糖作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

6周齡的雄性C57BL/6J野生型小鼠15只，體重（17.22±0.79）g、6周齡的ApoE-/-敲除雄性小鼠（C57BL/6J背景）30只，體重（20.12±0.96）g，均購自北京維通利華實驗動物公司（動物合格證號ApoE-/-：11400700037273，C57BL/6J：114007000372）。動物飼養(yǎng)于該中心SPF級動物實驗室，實驗室空氣潔凈級別7級，溫度（23±2）℃，濕度40%～70%，照明15 lx，明暗交替時間為12/12 h，所有小鼠均自由進食和飲水。實驗過程中，研究人員均人道地對待實驗動物，并嚴(yán)格遵守各項實驗動物倫理條例。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)。

艾塞那肽購自美國Sigma公司（批號：012M4751V）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α，批號：x30013313）和白細(xì)胞介素6（IL-6，批號：x30013325）、抵抗素（批號：X30013219）等酶聯(lián)免疫吸附劑測定（ELISA）試劑盒購于武漢華美生物工程公司。

1.2 動物模型的建立與分組

高脂飼料（1.25%膽固醇，余為普通飼料）喂養(yǎng)的6周齡雄性ApoE-/-小鼠30只，按隨機數(shù)字表法將其分為模型組（n = 15）與艾塞那肽組（n = 15）。模型組給予高脂飲食，艾塞那肽組模型組基礎(chǔ)上加用艾塞那肽1.0 nmol/（kg·d），腹膜下注射，2次/d。以15只6周齡的野生型C57BL/6J雄性小鼠作對照組，其飲食同模型組。連續(xù)喂養(yǎng)8周后，隨機抽取模型組ApoE-/-小鼠2只，1%戊巴比妥鈉80 mg/kg腹腔注射麻醉，充分麻醉后處死，分離并取出主動脈，先后常規(guī)脫水、再石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅（HE）染色，其后顯微鏡下觀察動脈粥樣硬化程度。以鏡下觀察到血管內(nèi)膜見明顯脂質(zhì)條紋隆起為動物造模成功。

1.3 血脂水平測定

各組繼續(xù)喂養(yǎng)至12周末，均禁食、禁飲過夜，次日予1%戊巴比妥鈉（80 mg/kg）腹腔注射充分麻醉，行摘除眼球取血法，采血量為2 mL/只。血液標(biāo)本靜置2 h，3500 r/min（離心半徑8.4 cm）高速離心6 min，取上層血清，用自動化生化分析儀測定血脂，包括總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、三酰甘油（TG），其中TC和TG使用酶比色法檢測，LDL-C和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）采用直接測定法。

1.4 血清抵抗素、TNF-α、IL-6水平測定

采用ELISA中的夾心法檢測血清抵抗素、TNF-α、IL-6水平。具體方法：①把標(biāo)準(zhǔn)品工作液先后加入前兩列孔中，各濃度工作液并列加兩孔，100 μL/孔。②各樣品分別標(biāo)記、編號，空白孔中加入100 μL樣品。③37℃反應(yīng)30 min。④洗板5次，每次靜置 10～20 s。⑤加入酶標(biāo)試劑，37℃反應(yīng)30 min。⑥再洗板5次，每孔各加50 μL A、B顯色液。⑦37℃條件下避光孵育10 min。⑧每孔各加終止液50 μL。⑨15 min內(nèi)用酶標(biāo)儀于450 nm波長處測定光密度（OD）值。⑩分別以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，以O(shè)D為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)各樣品OD值坐標(biāo)上確定樣本對應(yīng)的濃度值。

1.5 主動脈組織病理觀察及AS面積檢測

以明美數(shù)碼相機顯微鏡Mshot MC50觀察HE染色病理切片，以O(shè)LYMPUS圖像處理及分析軟件對各組小鼠主動脈切片的動脈粥樣硬化斑塊面積進行分析。動脈組織標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋，每張切片取3～5 μm厚度，連續(xù)切30張，每隔5張取1張行HE染色，各組取平均值作統(tǒng)計分析，分別檢測各組斑塊面積（PA）、血管管腔面積（LA），最后計算校正的斑塊面積（PA/LA），結(jié)果用百分比（%）表示。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，若方差齊，兩組間比較采用LSD-t檢驗，若方差不齊，則采用Dunnett′s T3檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠血清中的血脂水平比較

與對照組比較，模型組中TC、LDL-C、HDL-L、TG水平均較對照組顯著升高（均P < 0.01）；與模型組比較，艾塞那肽組的TC、LDL-C水平降低，HDL-L、TG水平升高，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P > 0.05）。見表1。

2.2 各組小鼠主動脈粥樣硬化病變形態(tài)學(xué)比較

對照組：動脈管腔內(nèi)膜光整，管壁各層結(jié)構(gòu)清晰，動脈內(nèi)膜未見明顯動脈粥樣斑塊。模型組：動脈管腔內(nèi)膜雜亂，內(nèi)膜和中模邊界欠清晰，可見明顯動脈粥樣斑塊，有大量泡沫細(xì)胞和膽固醇結(jié)晶。艾塞那肽組：動脈管腔內(nèi)可見少量粥樣斑塊， 脂質(zhì)核心較小，可見有少許泡沫細(xì)胞，與模型組比較，其病變程度較輕。見圖1（封四）。

2.3 各組小鼠主動脈粥樣硬化病變PA/LA比較

艾塞那肽組的PA/LA明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。見表2。

2.4 各組小鼠血清中TNF-α、IL-6、抵抗素水平比較

與對照組比較，模型組中血清抵抗素、TNF-α、IL-6水平明顯升高（均P < 0.01）。與模型組比較，艾塞那肽組血清抵抗素、TNF-α、IL-6水平均明顯降低（均P < 0.01）。見表3。

3 討論

近年來，慢性炎性反應(yīng)參與動脈粥樣硬化的發(fā)病機制逐漸得到國內(nèi)外學(xué)者的認(rèn)同。大量研究[11-14]證實炎癥細(xì)胞和炎癥信號通路的激活促進粥樣斑塊的形成和進展，加重斑塊不穩(wěn)定性。最新公布的CANTOS大規(guī)模臨床研究[15]表明，冠心病患者在降脂治療的基礎(chǔ)上給予抗炎性反應(yīng)藥物IL-1β單克隆抗體Canakinumab治療，比單用降脂治療組能顯著降低心肌梗死患者的心血管風(fēng)險，為進一步證實動脈粥樣硬化的慢性炎癥假說提供了直接證據(jù)。慢性炎性反應(yīng)涉及細(xì)胞主要有血管內(nèi)皮細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞以及平滑肌細(xì)胞等；涉及黏附分子主要有血管細(xì)胞黏附分子-1、細(xì)胞間黏附分子-1和單核細(xì)胞趨化蛋白-1；涉及細(xì)胞因子有TNF-α、IL-6和IL-12等[16]。迄今為止，國內(nèi)外多項研究[2， 8，17-19]已發(fā)現(xiàn)抵抗素與動脈粥樣硬化患者發(fā)病進程密切相關(guān)，且抵抗素水平與血漿中炎性因子水平呈正相關(guān)，抵抗素能促進TNF-α、IL-6、IL-12等炎性因子以及血管細(xì)胞黏附分子-1、細(xì)胞間黏附分子-1和單核細(xì)胞趨化蛋白-1等黏附分子的表達(dá)。Burnett等[19]研究顯示小鼠動脈粥樣硬化模型和動脈粥樣硬化患者中血漿抵抗素水平較對照組明顯升高，且兩者的動脈粥樣硬化斑塊中均有抵抗素表達(dá)，小鼠動物模型的動脈粥樣硬化進程中，其大動脈內(nèi)皮的抵抗素mRNA表達(dá)水平也明顯增加。Jamaluddin等[20]研究發(fā)現(xiàn)抵抗素可促進人內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，增加內(nèi)皮細(xì)胞通透性，促進內(nèi)皮細(xì)胞/單核細(xì)胞黏附和浸潤。Chen等[21]研究表明，抵抗素能增加人冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，降低內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）表達(dá)，減少一氧化氮（NO）的生成，誘導(dǎo)動脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷。

艾塞那肽屬于胰高血糖素樣肽-1受體激動劑類藥（GLP-1 RAs），是目前國內(nèi)外臨床上主要應(yīng)用于治療2型糖尿病的一類新型藥物。該藥具有控制血糖、改善胰島功能、促進胰島素增殖、降低體重、抑制細(xì)胞凋亡等作用[22]。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組小鼠經(jīng)高脂喂養(yǎng)12周后血清抵抗素及其下游炎性因子TNF-α、IL-6含量明顯增高，動脈粥樣硬化斑塊面積形成明顯；而艾塞那肽組小鼠的血清抵抗素及其下游炎性因子TNF-α和IL-6含量較模型組顯著降低，動脈粥樣硬化斑塊校正面積與模型組比較顯著減小，提示血清抵抗素在動脈粥樣硬化發(fā)病及進展中起著重要作用，艾塞那肽可能通過降低血清抵抗素水平，影響血管內(nèi)皮炎性反應(yīng)病理過程。

基于高糖環(huán)境和脂代謝紊亂等因素，糖尿病患者均有炎性反應(yīng)的病理基礎(chǔ)，炎性反應(yīng)將影響糖尿病心血管并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后[23]。糖尿病患者心血管并發(fā)癥發(fā)生早，發(fā)生率高，且其致殘率、致死率較高。有研究[24-25]顯示，糖尿病患者TNF-α、IL-6、IL-1β等炎性因子較健康者明顯升高，提示這些炎性因子是糖尿病心血管疾病的重要風(fēng)險因子。因此，對糖尿病患者早期積極進行抗炎干預(yù)，可降低其心血管并發(fā)癥的風(fēng)險。本研究結(jié)果顯示，艾塞那肽組與模型組比較，能降低致動脈粥樣硬化的主要血脂指標(biāo)TC和LDL-C，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），提示艾塞那肽的抗動脈粥樣硬化作用并非通過降低TC和LDL-C水平。艾塞那肽組血清抵抗素及其下游因子TNF-α和IL-6等炎癥指標(biāo)含量較模型組顯著降低，提示艾塞那肽應(yīng)用于2型糖尿病患者具有降糖兼抗炎作用，將可能有助于降低患者的心血管疾病風(fēng)險。

綜上所述，艾塞那肽干預(yù)能有效降低血清抵抗素水平，抑制炎性反應(yīng)，延緩動脈粥樣硬化進展，這可能是GLP-1 RAs有別于既往報道的抗動脈粥樣硬化作用機制，其具體機制有待進一步研究。

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（收稿日期：2019-01-29 本文編輯：王 蕾）