理沖湯對異種移植子宮肌瘤小鼠免疫逃逸相關因子的影響

劉宇 李冬華 王文娜

[摘要] 目的 從免疫逃逸角度探討“扶正祛瘀”中藥理沖湯對異種移植子宮肌瘤小鼠吲哚胺-2，3雙加氧酶（IDO）和叉頭狀螺旋轉錄因子3（Foxp3）表達的影響。 方法 采用完全隨機分組法將32只CB-17 Scid雌性小鼠分為正常組、模型組、理沖湯組和陽性藥組，每組8只。采用異種移植法制備子宮肌瘤動物模型；造模成功后，理沖湯組給予理沖湯，陽性藥組給予米非司酮，正常組和模型組給予等量生理鹽水，連續干預4周后進行組織樣本采集。通過HE染色觀察各組小鼠子宮平滑肌組織病理學改變；采用免疫印跡法檢測各組小鼠子宮平滑肌組織中IDO表達含量；采用實時熒光定量PCR檢測Foxp3 mRNA的表達含量。 結果 與模型組比較，理沖湯組小鼠子宮內膜及肌層增厚現象減輕，纖維組織含量較少；理沖湯組小鼠子宮平滑肌組織中IDO、Foxp3 mRNA表達含量較模型組明顯降低（P < 0.05或P < 0.01）。 結論 理沖湯具有抑制子宮肌瘤發生發展的作用，其藥理機制可能與阻斷腫瘤免疫逃逸途徑相關。

[關鍵詞] 理沖湯；子宮肌瘤；免疫逃逸；吲哚胺-2，3雙加氧酶；叉頭狀螺旋轉錄因子3

[中圖分類號] R737.33 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2019）05（a）-0012-04

Effect of Lichong Decoction on the expression of immune escape factors in the mice with heterograft uterine fibroids

LIU Yu LI Donghua WANG Wenna WEI Chao QIU Tiantian

College of Traditional Chinese Medicine， Capital Medical University， Beijing 100069， China

[Abstract] Objective To explore the effects of Lichong Decoction on the expression of indoleamine 2，3-dioxygenase （IDO） and forkhead winged helix transcription factor-3 （Foxp3） in xenograft mice with human uterine fibroids from the perspective of immune escape mechanism. Methods Thirty-two female mice of CB-17 scid were divided into normal group， model group， Lichong Decoction group and positive drug group according to completely randomized method， with 8 mice in each group. The animal model of uterine leiomyoma was established by xenotransplantation. After successful modeling， Lichong Decoction group was given Lichong Decoction， positive drug group was given Mifepristone， normal group and model group were given the same amount of saline， and tissue samples were collected after 4 weeks of continuous intervention. The histopathological changes of the uterine smooth muscle of mice in each group were observed by HE staining， and the expression of IDO in the smooth muscle tissue of mice in each group was detected by Western blot， and the expression of Foxp3 mRNA was detected by Real-time PCR. Results Compared with model group，the thickness of endometrium and muscle layer of mice in Lichong Decoction group was reduced， and the content of fibrous tissue was less compared with the model group. The expression of IDO and Foxp3 mRNA in uterine smooth muscle tissue of mice was significantly reduced in Lichong Decoction group （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion Lichong Decoction has the effect of inhibiting the occurrence and development of uterine fibroids， and its pharmacological mechanism may be related to blocking tumor immune escape.

[Key words] Lichong Decoction； Hysteromyoma； Immune escape； Indoleamine 2，3-dioxygenase； Forkhead winged helix transcription factor-3

子宮肌瘤（uterine leiomyoma）主要由子宮平滑肌細胞增生而成，因組織中含有起到支撐作用的纖維存在，故又稱為子宮纖維瘤，臨床上以腹部包塊、疼痛和出血等為主要癥狀[1]。子宮肌瘤作為婦科“第一瘤”，其發病率仍呈上升態勢，且患者愈發年輕化[2]。目前臨床上通常采用激素類調節藥物作為治療子宮肌瘤的常規藥物，但因激素的不良反應多而限制了其長期使用。經研究發現，中藥理沖湯可以通過誘導腫瘤細胞凋亡、抑制血管生成等方式抑制子宮肌瘤的發生發展[3-4]，但其是否能抑制腫瘤免疫逃逸還有待進一步考證。免疫逃逸是指腫瘤細胞通過多種方式逃避機體免疫系統的識別和攻擊，從而得以在體內生存和增殖的過程。子宮肌瘤作為腫瘤的一種，很有可能存在這一過程。因此，本研究以免疫逃逸為出發點，采用異種移植法制備子宮肌瘤小鼠模型，觀察中藥理沖湯對肌瘤組織形態學的改變，以及對免疫逃逸相關因子吲哚胺-2，3雙加氧酶（IDO）和叉頭狀螺旋轉錄因子3（Foxp3）表達的影響，旨在為臨床用藥提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 CB-17 Scid小鼠[北京維通利華實驗動物科技有限公司，SCXK（京）2016-0001]，雌性，未孕，6～9周齡，共32只，飼養于首都醫科大學SPF級動物房，恒溫（25～27℃），恒濕（45%～50%），使用獨立通氣籠盒。

1.1.2 實驗藥物 理沖湯：生黃芪9 g、黨參6 g、白術6 g、生山藥15 g、天花粉12 g、知母12 g、三棱9 g、莪術9 g、生雞內金9 g（北京同仁堂飲片有限責任公司），自制成含生藥量為1.7 g/mL的水煎劑；按照參考文獻[5]中的方法將米非司酮（北京紫竹藥業有限公司，43110 911）用0.5%羧甲基纖維素（Sigma，C5678）配制成濃度為0.7 g/mL的懸液；黃體酮注射液（上海通用公司，130905）；苯甲酸雌二醇注射液（天津金耀氨基酸公司，0703121）；堿性成纖維細胞生長因子（SAB公司，70402）；表皮生長因子（SAB公司，70504）。

1.1.3 儀器與試劑 光學顯微鏡（日本Olympus公司，TH-200/OLYMPUS V-RFL-T）；離心機（中國長沙湘儀離心機儀器有限公司，TDZ5-WS）；CO2培養箱（美國Sigma公司，HH CP-01W）；WB電泳儀（美國BIO-RAD公司，552BR143016）；實時熒光定量PCR儀（美國Gorbett Research公司，Rotor-Gene 3000）。IDO一抗（美國Abcam公司，Ab106134）；Foxp3一抗（美國Abcam公司，Ab36607）。

1.2 方法

1.2.1 人子宮肌瘤細胞懸液的制備 子宮肌瘤樣本來源于首都醫科大學附屬北京婦產醫院因患子宮肌瘤行全子宮切除術者，納入患者確認在術前3個月均未接受過激素和其他藥物治療，經病理學對子宮肌瘤樣本進行證實。無菌操作取手術切除新鮮子宮肌瘤組織約1 cm3，置于10 mL 3%雙抗（青鏈霉素）的PBS中，密閉冰浴迅速送入細胞培養室。將組織剪碎，在緩沖溶液中消化2～3 h后，進行碎片凈化，使用70 mm的過濾網收集細胞，在含20% FBS培養液和抗菌溶液的培養基中懸浮培養，收集新鮮子宮肌瘤細胞懸液立即用于小鼠宮內異種移植。

1.2.2 異種移植小鼠子宮肌瘤模型的建立 將32只CB-17 Scid雌性小鼠按完全隨機分組法分為正常組、模型組、理沖湯組和陽性藥組，每組8只。除正常組外，其他各組小鼠在異種移植之前，均使用雌激素和孕激素皮下釋放顆粒至少1周，以促進子宮發育。用甲苯噻嗪/氯胺酮對小鼠進行麻醉，剖腹探查術剝離子宮，在子宮左側分角處注入含有表皮生長因子（0.5 ng/mL）、堿性成纖維細胞生長因子（2 ng/mL）和胰島素（5 mg/mL）的基質膠，同時注入抗生素。將伊文思藍添加至子宮肌瘤細胞懸液中，并注入小鼠子宮右側分角處，以保證注射部位的可視化，術后進行腹膜傷口縫合。4周后每組隨機抽取1只小鼠對子宮組織進行組織病理學檢測，若子宮平滑肌層出現明顯增厚和纖維化，即確定造模成功。

1.2.3 藥物干預 所有藥物在灌胃前均加熱至30℃。理沖湯組每日灌服理沖湯濃縮液，用藥量為30 g/kg。陽性藥組每日灌服米非司酮懸液，用藥量為2.9 mg/kg。正常組和模型組小鼠每日灌以等量生理鹽水。連續灌服4周。

1.2.4 HE染色 對各組小鼠子宮進行肉眼觀察，然后取子宮分角以上0.5 cm相同部位一段子宮，10%中性甲醛固定，石蠟包埋切片，HE染色，光鏡下進行組織病理學檢查。

1.2.5 免疫印跡法 取250～500 mg經液氮凍存后的子宮肌瘤組織樣品，加1 mL含蛋白酶抑制劑的總蛋白裂解液（含蛋白酶抑制劑與磷酸化酶抑制劑），勻漿后抽提總蛋白，Lowry法測蛋白質含量。每例標本取蛋白100 μg，經10%聚丙烯凝膠電泳分離后電轉至PVDF膜，封閉后，加一抗（抗磷酸化多克隆抗體），4℃過夜，加二抗，37℃輕搖2 h，DAB顯色。顯色條帶在Quantity One分析軟件上測定灰度值，并進行定量分析。每次實驗重復4次，檢測理沖湯對小鼠子宮平滑肌組織IDO蛋白含量的影響。

1.2.6 實時熒光定量PCR（Real-time PCR）法 取子宮分角以上相同部位一段子宮，每50～100毫克組織樣品加入1 mL的Trizol，抽取待測樣品的RNA并進行質量檢測，使用SuperScript RT試劑盒，將樣品RNA逆轉錄為cDNA并進行擴增。以小鼠β-actin作為內參，由GenBank數據庫中獲得Foxp3基因序列，設計并合成相應的Real-time PCR引物。采用熒光定量PCR儀Bio-Rad CFX Manager軟件分析，查看Foxp3基因的擴增情況，記錄相應的Ct值，基因相對表達量采用公式2-ΔΔCt方法計算，并以此判定樣本中Foxp3基因mRNA表達量的差異。

1.3 統計學方法

采用SPSS 20.0統計學軟件包對所有數據進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析法（One-way ANOVA），組間進一步兩兩比較采用LSD-t或Tamhane′s T2法；非正態分布的計量資料比較采用非參數統計中的多個獨立樣本Kruskal-Wallis H檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HE染色病理分析

HE染色光鏡下觀察，正常組小鼠子宮平滑肌細胞排列整齊，呈流水樣，外縱行肌與內環行肌結構清晰，腺體上皮細胞為單層柱狀；模型組小鼠子宮平滑肌層明顯增厚，內環肌和外縱肌排列紊亂，肌束間出現大面積呈編織狀排列的纖維結締組織，肌細胞肥大、短縮，細胞核密集，腺體上皮細胞數目增多，密度增加，呈單層或復層柱狀；與模型組比較，理沖湯組小鼠子宮內膜及肌層增厚現象減輕，肌纖維排列較為整齊，部分縱橫交錯，肌間少有纖維結締組織出現，肌細胞形態規則，多數為長梭型，內膜腺體形態較為正常，呈單層柱狀或假復層。陽性藥組小鼠子宮平滑肌較模型組稍有變薄，肌纖維排列趨于整齊，肌細胞形態一致，部分出現肥大、短縮現象，內膜上皮細胞改變不明顯。見圖1。

2.2 免疫印跡法檢測免疫逃逸相關因子IDO表達水平

與正常組比較，模型組小鼠子宮平滑肌組織中IDO的蛋白表達水平明顯升高（P < 0.01）；與模型組比較，理沖湯組和陽性藥組小鼠子宮平滑肌組織中IDO蛋白表達水平明顯降低（P < 0.05）。見圖2、表1。

2.3 實時熒光定量PCR檢測Foxp3 mRNA的表達含量

與正常組比較，模型組小鼠子宮平滑肌組織中Foxp3 mRNA表達量明顯升高（P < 0.01）；與模型組比較，理沖湯組和陽性藥組小鼠子宮平滑肌組織中Foxp3 mRNA的表達量明顯降低（P < 0.01）。見表2。

3 討論

中藥理沖湯出自《醫學衷中參西錄》，此書為清代名醫張錫純所著。方中三棱、莪術破瘀除癥，生黃芪、黨參補氣護血，四藥合用補而不滯，破而不傷，天花粉、知母滋陰退熱，白術、生山藥、生雞內金益氣健脾。全方用藥巧妙，配伍嚴謹，共奏內補中氣、外清虛熱、活血化瘀、消癥除瘕之功，誠為治療“正虛血瘀”型子宮肌瘤之良藥。其藥效正如張錫純所言：“十余劑后，虛證自退，三十劑后，瘀血可盡消。”現代研究表明，黃芪中的皂苷及黃酮類成分可以起到提高T淋巴細胞亞群水平、增強機體免疫及抗腫瘤的作用[6-9]。三棱、莪術的有效成分可以降低血管內皮生長因子蛋白表達，具有抑制血管生成及抗血栓等作用[10-13]。

腫瘤細胞發生免疫逃逸需經過3個階段，即清除、平衡、逃逸[14-15]。最初，腫瘤細胞具有較強的抗原性，易被免疫系統所識別，免疫系統動用各種免疫機制可以清除大部分的腫瘤細胞。之后，未被免疫系統消滅的腫瘤細胞通過改變細胞表型等方式降低其自身抗原性，這種改變稱為免疫重塑（immune reconstitution），這時部分腫瘤細胞仍可以被免疫系統識別，但新的腫瘤重塑也會隨之出現，這樣腫瘤細胞與機體免疫達到一種“動態平衡”狀態，腫瘤細胞雖可被發現但也無法被徹底清除。直至免疫抑制因子達到一定含量，腫瘤微環境發生徹底改變，腫瘤細胞即可逃避免疫系統的攻擊而得以迅速生長，臨床上便可觀察到原發腫瘤[16]。

IDO在腫瘤細胞的免疫逃逸過程中發揮著重要作用。IDO是一種人體內固有的免疫調節酶，主要由抗原提呈細胞（APC）表達。IDO可以直接抑制T細胞的免疫活性，或者加速色氨酸耗竭，限制T細胞在增殖活動中完成抗原依賴性激活的環節而間接抑制T細胞活性[17-19]。此外，IDO在腫瘤中的過度表達還會影響CD3+T細胞、CD8+T細胞和CD57+NK細胞對腫瘤的浸潤[20]。Foxp3是叉狀頭轉錄因子家族中的一員，也是調節性T細胞（Treg）的標志性分子。Foxp3與Treg關系密切，經研究顯示，腫瘤患者外周血中的Foxp3和Treg均有不同程度的增高[21]。Treg具有免疫負性調節作用，Foxp3可以誘導CD4+ CD25- T細胞向CD4+ CD25+ Foxp3+T細胞轉化從而引起免疫抑制，最終導致腫瘤細胞實現免疫逃逸[22-23]。另外，Foxp3作為核內轉錄因子可以與靶基因結合，調節下游基因的表達進而完成腫瘤細胞的增殖和轉移[24]。

本研究發現，中藥理沖湯可以改善子宮平滑肌病理結構，降低IDO、Foxp3的表達水平，抑制子宮肌瘤的發生發展，其機制可能與抑制肌瘤細胞實現免疫逃逸有關。現階段，對于子宮肌瘤的治療仍有不盡人意之處，臨床上亟待一種安全有效、使用方便的藥物出現。本研究為子宮肌瘤的藥物研發提供實驗依據和研究思路，我們可以從腫瘤免疫逃逸角度出發，以特異性抑制IDO、Foxp3為治療靶點，重新恢復機體免疫功能，以達到在分子水平治療子宮肌瘤的目的。

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（收稿日期：2018-10-12 本文編輯：張瑜杰）