依達拉奉對大鼠腦缺血再灌注損傷的機制研究

米艷 高小平 朱清風(fēng)

[摘要] 目的 探討依達拉奉對腦缺血再灌注大鼠PDCD-5蛋白表達的影響。 方法 將體重為250～280 g的健康雄性SD大鼠78只按照隨機數(shù)字表法分為空白對照組（n = 6，生理鹽水，3 mg/kg，2次/d，腹腔內(nèi)注射）、假手術(shù)組（n = 24，生理鹽水，3 mg/kg，2次/d，腹腔內(nèi)注射）、腦缺血再灌注組（n = 24，生理鹽水，3 mg/kg，2次/d，腹腔內(nèi)注射）及藥物干預(yù)組（n = 24，依達拉奉3 mg/kg，2次/d，腹腔內(nèi)注射），后三組再隨機分為6 h組、1 d組、3 d組、7 d組。選擇改良Longa法建立腦缺血再灌注模型。比較各組神經(jīng)功能缺損情況、腦梗死面積及PDCD-5和Caspase-3蛋白在不同時期海馬組織中的表達。 結(jié)果 腦缺血再灌注組腦梗死灶較假手術(shù)組明顯增加（P < 0.05），藥物干預(yù)組腦梗死灶較腦缺血再灌注組明顯減少（P < 0.05）。同時，不同時間點腦缺血再灌注組的PDCD-5、Caspase-3蛋白表達均高于假手術(shù)組和藥物干預(yù)組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 依達拉奉對腦缺血再灌注大鼠海馬組織中PDCD-5的表達起抑制作用，并對大鼠腦缺血再灌注損傷起腦保護作用。

[關(guān)鍵詞] 腦缺血再灌注；PDCD-5；依達拉奉；大鼠

[中圖分類號] R743.3 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2019）05（a）-0016-04

Study on the mechanism of Edaravone on cerebral ischemia-reperfusion injury in rats

MI Yan1 GAO Xiaoping2 ZHU Qingfeng2 LUO Hailong3

1.Department of Electrophysiology， Hu′nan Thoracic Hospital， Hu′nan Province， Changsha 410000， China； 2.Department of Neurology， Hu′nan People′s Hospital， Hu′nan Province， Changsha 410000， China； 3.Department of Endoscopic Diagnosis， Hu′nan Thoracic Hospital， Hu′nan Province， Changsha 410000， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of Edaravone on the expression of PDCD-5 protein in rats with cerebral ischemia reperfusion. Methods Seventy-eight healthy male SD rats with a healthy weight of 250-280 g were randomly divided into blank control group （n = 6， normal saline， 3 mg/kg， twice a day， intraperitoneal injection）， sham operation group （n = 24， normal saline， 3 mg/kg， twice a day， intraperitoneal injection）， cerebral ischemia reperfusion group （n = 24， normal saline， 3 mg/kg， twice a day， intraperitoneal injection） and drug intervention group （n = 24， Edaravone 3 mg/kg， twice a day， intraperitoneal injection） according to random number table method， and the latter 3 groups were randomly divided into 6 h group， 1 d group， 3 d group and 7 d group. A modified Longa method was used to establish cerebral ischemia-reperfusion model. The neurological deficit， the acreage of cerebral infarction and the expression of PDCD-5 and Caspase-3 protein in hippocampus of different periods were compared. Results The cerebral infarction in cerebral ischemia reperfusion group was significantly increased compared with sham operation group （P < 0.05）； the cerebral infarction in drug intervention group was significantly reduced compared with cerebral ischemia reperfusion group （P < 0.05）. At the same time， the expression of PDCD-5， Caspase-3 protein in cerebral ischemia-reperfusion group at different time points was higher than those in corresponding sham-operation group and corresponding drug intervention group （P < 0.05）. Conclusion Edaravone can inhibit the expression of PDCD-5 in the hippocampus of rats with cerebral ischemia-reperfusion， and protect the brain against cerebral ischemia-reperfusion injury in rats.

[Key words] Cerebral ischemia reperfusion； PDCD-5； Edaravone； Rat

腦血管病以缺血性腦血管病居多，急性缺血性腦血管病約占所有腦血管病的80%[1]。腦缺血再灌注后腦組織的損傷機制很多，包括自由基釋放[2]、鈣泵破壞[3]、炎性反應(yīng)[4]、細胞凋亡[5-6]等機制，而腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)元發(fā)生細胞凋亡對腦組織的損害起著重要作用，神經(jīng)元凋亡與缺血的類型、嚴(yán)重程度、再灌注時間的長短有關(guān)。而依達拉奉是一種新型的自由基清除劑，具有抗細胞凋亡和神經(jīng)保護作用。PDCD-5是我國從白血病株TF-1細胞中克隆得到的擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的新功能基因，是細胞凋亡的正調(diào)節(jié)分子，能結(jié)合Caspase-3[7-8]。本研究旨在探究依達拉奉對腦缺血再灌注大鼠PDCD-5和Caspase-3蛋白表達的影響，為臨床缺血性腦血管病的防治尋找可能的新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選擇10～12周齡、體重250～300 g的清潔級健康雄性SD大鼠78只，由湖南斯萊克景達實驗有限公司提供，質(zhì)量合格證號：SYXK（湘）2010-0013，大鼠置于室溫在20～23℃的喂養(yǎng)室，每日定時喂食、換水，按自然晝夜生物節(jié)律活動。動物的使用符合倫理學(xué)要求（湖南省人民醫(yī)院倫理委員會）。按照隨機數(shù)字表法將其分為空白對照組（n = 6）、假手術(shù)組（n = 24）、腦缺血再灌注組（n = 24）及藥物干預(yù)組（n = 24），后三組再隨機分為6 h組、1 d組、3 d組、7 d組。

1.2 試劑

PDCD-5和Caspase-3的一抗由Proteintech Group（PTG）公司（美國，芝加哥）提供，貨號分別為12456-1-AP和19677-1-AP。依達拉奉試劑由南京先聲藥業(yè)提供，批號：80-150409。

1.3 模型制備

本研究在Longa等[9]模型的基礎(chǔ)上改進和完善，選擇大鼠的頸總動脈入路。大鼠術(shù)前不禁水，不過要求禁食12 h，采用0.3 mL/100 g水合氯醛（10%）腹腔注射大鼠實施麻醉，大鼠正中右側(cè)旁開0.5 cm行縱行切口，分離出右側(cè)頸總動脈（common carotid artery，CCA），然后分離大鼠動脈鞘，將迷走神經(jīng)和CCA分開，并向上分離至分叉處，使大鼠頸外動脈（external carotid artery，ECA）和頸內(nèi)動脈（internal carotid artery，ICA）徹底分離，用兩根備好的尼龍線結(jié)扎頸總動脈，近心端應(yīng)結(jié)扎緊，遠心端在線栓未插入之前不應(yīng)結(jié)扎緊，并用微型動脈夾夾閉頸內(nèi)動脈。此時在頸總動脈結(jié)扎尼龍線之間用眼科剪一大小約3 mm的小口。用眼科鑷夾住線栓從頸總動脈切口往頸內(nèi)動脈插入，當(dāng)線栓插入18.5（±0.5）mm。此時結(jié)扎頸總動脈遠端的尼龍線以固定線栓，將栓線尾端剪斷并留大概10 mm漏出大鼠皮膚表面，然后縫合大鼠筋膜和皮膚。接著給大鼠局部使用慶大霉素預(yù)防傷口感染，術(shù)后將大鼠置于空調(diào)房保暖。待栓線栓塞2 h后再實施灌注，將栓線拔出至CCA的遠端結(jié)扎線處，剪斷血管外的栓線。術(shù)后大鼠分籠飼養(yǎng)。

1.4 實驗分組

正常對照組不做任何處理。假手術(shù)組模型制作過程與實驗組相同，栓線僅進入頸內(nèi)動脈10 mm，并于2 h后再實施灌注。藥物干預(yù)組制備過程與腦缺血再灌注組一樣，只是造模后立即予以依達拉奉注射液（按3 mg/kg腹腔注射）干預(yù)，而假手術(shù)組、腦缺血再灌注組及空白對照組予以相同劑量的生理鹽水干預(yù)。

1.5 神經(jīng)功能缺損評分

參考Longa等[9]5分制評分標(biāo)準(zhǔn)進行神經(jīng)功能評定。0分：無神經(jīng)損傷體征；1分：提鼠尾時不能完全伸展左側(cè)前爪；2分：行走時大鼠身體向左側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：行走時大鼠身體向左側(cè)傾倒；4分：無自發(fā)活動或伴有意識喪失。評分越高表明神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。大鼠的神經(jīng)功能評分由兩人共同完成，消除主觀因素。0分和4分予以剔除，術(shù)中及術(shù)后動物死亡或取材時發(fā)現(xiàn)有蛛網(wǎng)膜下腔出血均視為造模失敗，予以刪除樣本，并從同批次的大鼠中隨機補充。

1.6 TTC染色

將大鼠于實驗組對應(yīng)的結(jié)束時間點處死，斷頭取腦，觀察鼠腦大體形態(tài)，去除小腦和腦干，置于0～4℃的生理鹽水中10 min，自后向前進行2 mm厚的冠狀切片，置2% TTC/磷酸緩沖液中，37℃避光孵育30 min，后置4%多聚甲醛/PBS中固定6 h，觀察腦梗死灶呈色情況，正常腦組織呈紅色，梗死的腦組織呈白色。

1.7 PDCD-5和Caspase-3蛋白的表達

采用Western blot方法檢測大鼠海馬區(qū)PDCD-5蛋白和Caspase-3蛋白的表達（內(nèi)參為GAPDH），所有的操作步驟都是按試劑盒的方法和步驟來完成。陽性條帶采用Gel pro4.0版凝膠光密度分析軟件分析，檢測累積光密度（IOD）參考值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組計量資料采用兩樣本t檢驗，多組間計量資料采用方差分析，多組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義后采用SNK-q檢驗進行兩兩間的比較，方差不齊則采用非參數(shù)檢驗LSD-t檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能缺損評分

2.1.1 各組神經(jīng)功能缺損評分分布情況 腦缺血再灌注組和藥物干預(yù)組的神經(jīng)功能評分為0分及4分的大鼠已被剔除，從同批次的大鼠中隨機補充。各組神經(jīng)功能缺損評分分布見表1。

2.1.2 各組神經(jīng)功能缺損評分比較 假手術(shù)組神經(jīng)功能缺損評分為0分，腦缺血再灌注組為（2.13±0.68）分，藥物干預(yù)組為（1.58±0.65）分，其中腦缺血再灌注組神經(jīng)功能缺損評分高于假手術(shù)組（P < 0.05），藥物干預(yù)組神經(jīng)功能缺損評分低于腦缺血再灌注組（P < 0.05）。

2.2 TTC染色

各組腦組織TTC染色結(jié)果顯示，空白對照組與假手術(shù)組未見梗死灶，腦缺血再灌注組與藥物干預(yù)組均可見明顯的梗死，見圖1。藥物干預(yù)組腦梗死面積[（27.02±1.75）mm2]較腦缺血再灌注組[（32.61±2.11）mm2]明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。

2.3 PDCD-5蛋白表達

各時間點不同組的PDCD-5蛋白表達如圖2、表2所示，不同時間點腦缺血再灌注組、藥物干預(yù)組的PDCD-5蛋白表達均高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；不同時間點藥物干預(yù)組的PDCD-5蛋白表達均明顯低于腦缺血再灌注組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。

2.4 Caspase-3蛋白表達

各時間點不同組的Caspase-3蛋白表達如圖3、表3所示，不同時間點腦缺血再灌注組、藥物干預(yù)組的Caspase-3蛋白表達均明顯高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；不同時間點藥物干預(yù)組Caspase-3蛋白表達均明顯低于腦缺血再灌注組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。

3 討論

PDCD-5是我國從白血病株TF-1細胞中克隆得到的擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的新功能基因，PDCD-5的研究目前涉及腫瘤、風(fēng)濕免疫系統(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)疾病和心腦血管疾病[10-12]。PDCD5是一種十分重要的正調(diào)基因[13]。機體受到各種刺激時，在不同類型細胞中的PDCD-5可加速細胞凋亡，并且通過調(diào)控細胞凋亡從而實現(xiàn)不同疾病類型的監(jiān)控功能[14]。細胞凋亡通路主要包括線粒體/細胞色素C通路、死亡受體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路[15]，而且三者都與Caspase家族有關(guān)。Caspase-3是Caspase家族非常重要的一種凋亡執(zhí)行者，是細胞凋亡過程中的主要效應(yīng)因子之一。細胞凋亡進入不可逆階段的標(biāo)志之一就是Caspase-3的活化。PDCD-5是細胞凋亡的正調(diào)節(jié)分子，通過和Caspase-3的結(jié)合，PDCD-5通過直接或間接途徑促進Caspase-3的凋亡效應(yīng)[16-17]。細胞凋亡的核心成分是半胱氨酸蛋白酶家族（Caspase），Caspase包括凋亡啟動因子、凋亡執(zhí)行因子和炎癥介導(dǎo)因子三大類，從而形成級聯(lián)放大效應(yīng)，活化Caspase可以發(fā)揮降解細胞功能蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白的作用，從而引起細胞凋亡；而細胞凋亡過程的關(guān)鍵酶之一就是Caspase-3[17]。因此機體PDCD-5通過結(jié)合Caspase-3可以實現(xiàn)Caspase-3的正調(diào)節(jié)效應(yīng)。

研究表明摧毀PDCD5基因的小鼠大腦中動脈閉塞模型與野生型小鼠相比有更好的大腦微循環(huán)保護模式[18]。本研究結(jié)果顯示，藥物干預(yù)組PDCD-5和Caspase-3明顯低于腦缺血再灌注組，而且腦梗死面積及神經(jīng)功能缺損評分同樣明顯低于腦缺血再灌注組。本研究結(jié)果提示，依達拉奉可以抑制PDCD-5的表達，這與Caspase-3密切相關(guān)，從而發(fā)揮腦保護的作用，但是通過何種途徑尚未得到證實。研究證實，PDCD-5是一種細胞凋亡正調(diào)控基因，并且調(diào)控過程中與細胞色素C密切相關(guān)[19-20]，而線粒體/細胞色素C通路是細胞凋亡的重要通路，可激活Caspase-3而引發(fā)細胞凋亡。

綜上所述，依達拉奉可能因為減少了機體PDCD-5的表達，進而抑制細胞色素C結(jié)合Caspase-3調(diào)控的細胞凋亡通路及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而抑制機體缺血再灌注損傷。

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（收稿日期：2018-06-12 本文編輯：張瑜杰）