補脾清肺方對耐藥銅綠假單胞菌毒力因子的影響

樊長征 周偉 張勇鵬

[摘要] 目的 探討補脾清肺方治療下呼吸道耐藥銅綠假單胞菌（PA）感染的作用機制，為治療PA所致下呼吸道感染提供依據。 方法 SPF級雄性SD大鼠，體重240～260 g，2～3月齡，共30只，設空白對照組（n = 10），不造模，給予等體積生理鹽水灌服；模型組（n = 10），造模后，給予等體積生理鹽水灌服；中藥組（n = 10），造模后，給予2倍劑量（10.68 g）中藥灌服，以PA液注入大鼠氣管內的方法建立大鼠下呼吸道感染模型，以補脾清肺方進行干預。測定彈性蛋白酶及綠膿菌素含量。 結果 在彈性蛋白酶含量上，中藥組與模型組比較，中藥組彈性蛋白酶含量降低，差異有統計學意義（P < 0.05）；中藥組與空白對照組比較，中藥組彈性蛋白酶含量升高，差異無統計學意義（P > 0.05）；模型組與空白對照組比較，模型組彈性蛋白酶含量升高，差異有統計學意義（P < 0.05）。在綠膿菌素含量上，中藥組與模型組比較，中藥組綠膿菌素含量升高，差異無統計學意義（P > 0.05）；中藥組與空白對照組比較，中藥組綠膿菌素含量升高，差異無統計學意義（P > 0.05）；模型組與空白對照組比較，模型組綠膿菌素含量升高，差異無統計學意義（P > 0.05）。 結論 補脾清肺方可以顯著減輕氣道炎性反應，降低彈性蛋白酶的含量，減輕PA侵襲。

[關鍵詞] 補脾清肺中藥；中醫藥治療；耐藥銅綠假單胞菌；下呼吸道感染；毒力因子

[中圖分類號] R28；R73 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2019）05（a）-0020-05

Effect of Bupi Qingfei Decoction on virulence factors of drug-resistant Pseudomonas aeruginosa

FAN Changzheng1 ZHOU Wei2 ZHANG Yongpeng3 TANG Xudong4 FAN Maorong1 MIAO Qing1 ZHANG Qiong1 YUAN Shasha1

1.Department of Respiration， Xiyuan Hospital of China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100091， China； 2.Department of Respiration， Beijing Chinese Medicine Hospital Pinggu Branch， Beijing 101200， China； 3.Department of Internal Medicine， Huanghua Development Zone Bo′ai Hospital， Hebei Province， Cangzhou 061100， China； 4.China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China

[Abstract] Objective To investigate the mechanism of Bupi Qingfei Decoction in the treatment of drug-resistant Pseudomonas aeruginosa （PA） infection of the lower respiratory tract， to provide evidence for the treatment of PA-induced lower respiratory tract infection. Methods A total of 30 SPF male SD rats， weighing 240-260 g， aged 2-3 months. Blank control group （n = 10） was set， no model was made， and equal volume of normal saline was given. In the model group （n = 10）， normal saline of equal volume was administered after modeling. The rats in the traditional Chinese medicine group （n = 10） were given 2 times the dose （10.68 g） of traditional Chinese medicine after modeling， and the rats′ lower respiratory tract infection model were established by injecting PA solution into rats′ trachea， given Bupi Qingfei Decocion for intervention. The contents of elastase and pyocyanine were determined. Results In terms of elastase content， compared with the model group， the elastase content in the traditional Chinese medicine group decreased， and the difference was statistically significant （P < 0.05）. Compared with the blank control group， elastase content in the traditional Chinese medicine group increased， and the difference was not statistically significant （P > 0.05）. Compared with the blank control group， the elastase content in the model group increased， and the difference was statistically significant （P < 0.05）. In terms of the content of pyocyanine， compared with the model group， the content of pyocyanine increased in the traditional Chinese medicine group， and the difference was not statistically significant （P > 0.05）. Compared with the blank control group， pyocyanine content increased in the TCM group， and the difference was not statistically significant （P > 0.05）. Compared with the blank control group， the content of pyocyanine in the model group increased， and the difference was not statistically significant （P > 0.05）. Conclusion Bupi Qingfei Decoction can significantly improve airway inflammation， reduce the content of elastase and relieve the PA′s invasion.

[Key words] Bupi Qingfei Decoction； TCM treatment； Drug-resistant Pseudomonas aeruginosa； Lower respiratory tract infection； Virulence factor

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是院內下呼吸道感染最常見病原體之一；也是支氣管擴張癥等結構性肺病的定植菌，并誘發反復感染。現有抗生素治療對耐藥PA下呼吸道感染作用有限，從而導致肺衰竭最終導致患者死亡。PA是一種機會主義病原體，它利用群體密度感應（quorum-sensing，QS）系統來協調多種毒力因子的表達[1]，毒力因子可以幫助病原體侵入并抵抗宿主的防御機制，增強致病能力。PA產生的毒力因子包括彈性蛋白酶、綠膿菌素和外毒素A等。研究表明，毒力因子產生的毒害與QS系統關系十分密切[2-3]。PA的耐藥機制復雜，是醫院獲得性感染重要的病原菌，其中彈性蛋白酶、綠膿菌素等毒力因子的表達是PA耐藥的重要原因之一，同時PA致病能力的強弱由毒力因子的表達與變化決定。研究表明，PA的QS系統可以調控多種毒力因子表達，如彈性蛋白酶、綠膿菌素等[4]。同時通過對QS的研究發現，PA的毒力因子表達、生物被膜等眾多致病因子被QS系統控制，特別是彈性蛋白酶的產生受QS系統高度控制，特異性抑制QS系統，能夠在不影響細菌生存的情況下抑制細菌的多種毒力因子表達[5-6]。而從豐富的中醫藥治療下呼吸道感染臨床經驗中尋找有效方藥并研究其對PA毒力因子的影響及機制有可能為中醫藥治療下呼吸道耐藥PA感染提供新思路及新方法。據此，本研究采用PA菌液注入大鼠氣管內的方法建立大鼠下呼吸道感染模型，并以此為研究對象，給予補脾清肺方干預治療，觀察下呼吸道PA感染模型大鼠氣管肺組織病理學及檢測PA的主要毒力因子（彈性蛋白酶、綠膿菌素等）的分泌改變，探索補脾清肺方治療下呼吸道PA感染的初步機制，為下呼吸道耐藥PA感染中醫藥防治提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 SPF級健康成年雄性SD大鼠，購于斯貝福（北京）實驗動物科技有限公司，體重240～260 g，2～3月齡，許可證號：SCXX（京）2011-0004。飼養于中國中醫科學院西苑醫院動物實驗中心，空調下架式籠養，環境溫度（23±3）℃，濕度（55±5）%，每天自由飲水（清潔自來水）及進食標準飼料。

1.1.2 菌株 PA購于中國藥物檢驗所，菌株復蘇鑒定后培養，監測OD值為600，收獲6×108 CFU/mL新鮮菌供后續實驗。

1.1.3 主要儀器 圖像分析軟件（LOGENE-I醫用圖像處理系統）；病理切片機（德國，LEICA RM2235）；37℃恒溫箱；標準規格酶標儀。普通光學顯微鏡（日本，OLYMPUS BX41）

1.1.4 主要試劑 大鼠彈性蛋白酶ELISA試劑盒（批號：JK-ELISA-13082）；氯仿（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20170215）。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型制作 以PA菌液注入大鼠氣管內的方法建立下呼吸道PA感染大鼠模型，造模型大鼠20只，同時設空白對照組大鼠10只，共30只。動物均在無菌環境中飼養。記錄模型的成功率、穩定性及均衡性。

下呼吸道PA感染大鼠模型：除空白對照組外，其余各組大鼠參照本課題組最新建立的下呼吸道PA感染大鼠模型制備方法：大鼠腹腔注射戊巴必妥鈉麻醉后仰臥位固定，選擇唇下3 cm處常規消毒作縱向1 cm切口，暴露頜下肌群，縱向分離出氣管。選擇甲狀軟骨下較寬的氣管軟骨間隙以微量進樣器插入氣管中快速注入0.02 mL（108 CFU/L）PA菌液和l mL氣體，迅速拔出微量進樣器并豎起固定板，保持大鼠垂直體位，以緩解呼吸障礙。待大鼠呼吸平穩后橫向縫合頸部肌群及皮膚。腹腔注射青霉素3 d，預防傷口感染。每天以50%葡萄糖液100 mL/kg灌胃3 d。14 d后評價模型是否成功。模型成功標準[7]：病理學可見擴張支氣管被覆上皮細胞增生、脫落；以膿細胞、單核細胞、淋巴細胞為主的大量炎癥細胞浸潤；黏膜下層萎縮，平滑肌萎縮、斷裂被纖維組織代替；浸潤處形成支氣管炎、支氣管周圍炎、肺炎等斑片狀病灶。

1.2.2 分組設計 設空白對照組10只，不造模，給予等體積生理鹽水灌服；模型組10只，造模后，給予等體積生理鹽水灌服；中藥組10只，造模后，給予2倍劑量（10.68 g）中藥灌服。對造模過程中由于操作失誤而致死亡者給予補充。

1.2.3 給藥方案 補脾清肺方組成：黨參20 g、炙黃芪30 g、柴胡10 g、前胡10 g、烏梅10 g、黃連6 g、魚腥草30 g、黃芩15 g、法半夏10 g、茯苓15 g、桔梗12 g、炙甘草10 g。給藥量根據人與大鼠體表面積換算方法計算，按人體每日用藥量的2倍劑量給藥。采用配方顆粒進行中藥質量控制。成人每日生藥量（平均體重50 kg）3.56 g/kg，大鼠每日生藥量（平均體重250 g）21.36 g/kg，1倍劑量=5.34 g。模型成功后，第2天開始灌胃給藥，飼料正常。連續用藥14 d。

1.2.4 大鼠氣管肺泡灌洗液的采集 最后一次用藥后24 h，各組大鼠腹腔注射戊巴必妥鈉麻醉后仰臥位固定，選擇唇下3 cm處常規消毒作縱向1 cm切口，暴露頜下肌群，縱向分離出氣管，暴露氣管，結扎甲狀軟骨端。自甲狀軟骨向氣管內注射生理鹽水5 mL，反復沖洗3次，每只大鼠盡可能抽回沖洗液5 mL作為銅綠假單胞菌培養物，然后進行過濾分裝冷藏保存備用。

1.2.5 彈性蛋白酶含量測定 按大鼠彈性蛋白酶的ELISA試劑盒說明進行操作。準備試劑，氣管肺泡灌洗液樣品和標準品，加入準備好的樣品和標準品，37℃反應90 min，洗板2次，加入生物素化人血管生成素（ANG）抗體工作液，37℃反應60 min，洗板3次，加入ABC工作液，37℃反應30 min，洗板5次，加入TMB顯色液，37℃反應，加入TMB終止液，30 min內讀OD值，計算標本彈性蛋白酶含量。

1.2.6 綠膿菌素測定 采用氯仿萃取法，步驟如下：取1 mL氣管肺泡灌洗液做PA培養物，取菌液3 mL測定其OD值600后加入3 mL氯仿萃取，然后在萃取到1 mL的0.2 N的HCl中，得到一個澄清透明的液體，測定其在520 nm處OD值，即為菌液綠膿菌素的相對濃度。相同條件重復實驗3次。

1.3 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 彈性蛋白酶含量測定

中藥組與模型組比較，中藥組彈性蛋白酶含量降低，差異有統計學意義（P < 0.05）；中藥組與空白對照組比較，中藥組彈性蛋白酶含量升高，差異無統計學意義（P > 0.05）；模型組與空白對照組比較，模型組彈性蛋白酶含量升高，差異有統計學意義（P < 0.05）。空白對照組彈性蛋白酶含量最低，模型組彈性蛋白酶含量最高。見表1。

2.2 綠膿菌素含量測定

中藥組與模型組比較，中藥組綠膿菌素含量升高，差異無統計學意義（P > 0.05）；中藥組與空白對照組比較，中藥組綠膿菌素含量升高，差異無統計學意義（P > 0.05）；模型組與空白對照組比較，模型組綠膿菌素含量升高，差異無統計學意義（P > 0.05）。中藥組綠膿菌素最高，空白組綠膿菌素最低。見表2。

3 討論

目前直接殺死細菌和減弱其毒力是控制PA感染的主要策略。直接殺死細菌策略被廣泛應用，抗菌藥物的廣泛應用，產生細菌多重耐藥、菌群失調等多方面的負面作用。研究者們開始研究減弱細菌毒力的策略，選擇阻止細菌的毒力使其無法對抗宿主免疫防御，進而被機體清除[8]。國內外以干擾群體感應系統作為抗菌靶位的新藥物研究試驗較多。PA的毒力因子表達、生物被膜等眾多致病因子被QS系統控制，特別是彈性蛋白酶的產生受QS系統高度控制，特異性抑制QS系統，能夠在不影響細菌生存的情況下抑制細菌的多種毒力因子表達[9-10]。一是海洋藍藻細菌提取物，通過干擾LasR活性影響PA毒力。二是抗生素類，如環丙沙星、阿奇霉素、頭孢他啶等在其亞抑菌濃度下能夠通過干擾細菌群體感應系統影響PA毒力。三是濃度為5%的人參浸出液，能抑制群體感應系統，降低蛋白酶活性影響PA毒力。還有學者[11]利用群體感應系統抑制物選擇器篩選出一些影響群體感應系統的非毒性化合物，如純化學藥品、食物分離物和中草藥等。上述研究均取得了不同程度的研究成果，不過這些研究大多為體外研究，未能在臨床治療中得到試驗及運用。

中醫藥治療耐藥細菌感染方面具有獨特的作用優勢，臨床中常用中藥聯合抗生素治療耐藥性PA感染疾病[11]。筆者發現在古文獻，元代沙圖穆秀克所著《瑞竹堂經驗方·羨補門》柴前連梅散治療咳嗽日久，咳吐青綠痰病證，效果非常明顯，這與下呼吸道耐藥PA感染患者反復咳吐青綠痰與之咳嗽日久、咳吐青綠痰病證非常相似。在以上基礎上筆者自擬補脾清肺方用來治療下呼吸道耐藥PA感染，取得了一定效果。本研究團隊回顧總結了下呼吸道感染90例患者的中醫證候進行調查，發現46.7%的患者存在脾虛證，初步證實補脾清肺中藥能夠改善患者的免疫功能，減輕癥狀[12]。在此基礎上運用補脾清肺中藥（補中柴前連梅煎）治療70例下呼吸道PA感染（支氣管擴張癥）患者12周，隨訪12周，試驗組的急性加重次數為0.48次/人，對照組為0.53次/人，可明顯減少急性加重次數[13]。前期研究[14]表明補脾清肺方可明顯改善下呼吸道PA感染模型大鼠血管周圍炎性浸潤、間質性肺炎及細支氣管支氣管周圍炎性浸潤，其作用主要為整體調理作用。本研究從分子生物學方面研究補脾清肺方對下呼吸道PA感染毒力因子的影響機制。

彈性蛋白酶的毒性作用主要有：①降解人體非膠原蛋、白細胞膠原等，使肺基底膜完整性受損，致肺氣道物理屏障破壞；②干擾人體免疫應答，降解免疫球蛋白IgG和IgA；③干擾纖維細胞生長，水解生物被膜內部運輸孔道[15]；④破壞肺部結構，降解肺彈性蛋白，影響肺部的收縮和舒張，引起肺損傷[16]。綠膿菌素毒性作用[17]主要有：①抑制呼吸道纖毛的功能，使PA在呼吸道更容易定植；②抑制宿主對病原體的特異性免疫清除；③阻斷細胞呼吸鏈，致細胞死亡。潘婷婷等[18]發現PA的QS基因表達量越高，彈性蛋白酶的活力越強，毒力作用越強，致病力越強。綠膿菌素分泌量與PA的LasI基因表達量成正相關，因此，QS可通過增強PA的彈性蛋白酶活力，使PA進一步侵襲宿主，加重患者病情。有兩項研究[19-20]也證實了LasR和RhlR基因參與了綠膿菌素分泌。本研究發現補脾清肺方可以降低支氣管擴張并PA感染大鼠氣管肺泡灌洗液中彈性蛋白酶的含量，而對綠膿素的含量無明顯影響，說明補脾清肺方可以降低PA毒力因子彈性蛋白酶的表達，進而改善PA感染，但補脾清肺方如何影響PA群體感應系統進而降低彈性蛋白酶的表達需要進一步研究。補脾清肺方對綠膿素的表達無影響，需要進一步研究補中柴前連梅煎對PA的LasI基因表達的影響，是否因基因表達無增加而導致綠膿素含量無增加。

4 小結

本研究通過補脾清肺方干預下呼吸道PA感染大鼠模型的反應性效應及PA毒力因子（彈性蛋白酶含量及綠膿菌素）變化，探討了補脾清肺方治療下呼吸道PA感染的作用機制，結果提示補脾清肺方可以顯著減輕氣道炎癥，降低彈性蛋白酶的含量，減輕PA侵襲。仍需進一步研究補脾清肺方對PA群體感應系統的影響機制。

[參考文獻]

[1] Wysoczynski-Horita CL，Boursier ME，Hill R，et al. Mechanism of agonism and antagonism of the Pseudomonas aeruginosa quorum sensing regulator QscR with non-native ligands [J]. Mol Microbiol，2018. doi：10.1111/mmi.13930.

[2] Jensen PO，Bjarnsholt T，Phipps R，et al. Rapid necrotic killing of polymor-phonuclear leukocytes is caused by quorum-sensing-controlled production of rhamnolipid by Pseudomonas aeruginosa [J]. Microbiology，2007，153（5）：1329-1338.

[3] Thaden JT，Lory S，Gardner TS. Quorum-sensing regulation of a copper toxicity system in Pseudomonas aeruginosa [J]. J Bacteriol，2010，192（10）：2557-2568.

[4] Alayande AB，Aung MM，Kim IS. Correlation Between Quorum Sensing Signal Molecules and Pseudomonas aeruginosa′s Biofilm Development and Virulency [J]. Curr Microbiol，2018. doi：10.1007.

[5] 陳代杰.微生物藥物學[M].2版.北京：化學工業出版社，2008：269-290.

[6] Gupta P，Chhibber S，Harjai K. Subinhibitory concentration of ciprofloxacin targets quorum sensing system of Pseudomonas aeruginosa causing inhibition of biofilm formation & reduction of virulence [J]. Indian J Med Res，2016， 143（5）：643-651.

[7] 萬毅剛，曹世宏，畢建軍，等.大鼠支氣管擴張癥模型研制[J].上海實驗動物科學，2000，20（2）：65-68.

[8] Cegelski L，Marshall GR，Eldridge GR，et al. The biology and future prospects of antivirulence therapies [J]. Nat Rev Microbiol，2008，6（1）：17-27.

[9] Olivier MV，Martin K，Sanda R，et al. Identification of catechin as one of the flavonoids from combretum albiflorum bark extract that reduces the production of Quorum-Sensing-controlled virulence factors in Pseudomonas aeruginosa PAO1 [J]. Appl Environ Microb，2010，76（1）：243-253.

[10] Francesco I，Francesco M，Cejoice RP，et al. New life for an old drug：the anthelmintic drug niclosamide inhibits Pseudomonas aeruginosa quorumsensing [J]. Antimicrob Agents Chemother，2013，57（2）：996-1005.

[11] 周至品，楊興秀，葉曉雪.傳統藥物對銅綠假單胞菌生物被膜作用研究進展[J].中藥藥理與臨床，2015，31（6）：230-235.

[12] 宋雪萍.補脾清肺湯治療支氣管擴張癥（脾虛肺熱證）的臨床觀察[D].北京：北京中醫藥大學，2015.

[13] 樊長征.補中柴前連梅煎減少支氣管擴張患者急性加重次數的臨床療效研究[D].北京：中國中醫科學院，2016.

[14] 樊長征，張文江，任培忠，等.補中柴前連梅煎對支氣管擴張癥大鼠模型肺氣管組織病理學的影響[J].世界中醫藥，2016，11（11）：2370-2374.

[15] McCarty SM，Cochrane CA，Clegg PD，et al. The role of endogenous and exogenous enzymes in chronic wounds：afocus on the implications of aberrant levels of both host and bacterial proteases in wound healing [J]. Wound Repair Regen，2012，20（2）：125-136.

[16] Beaufort N，Corvazier E，Mlanaoindrou S，et al. Disruption of the endothelial barrier by proteases from the bacterial pathogen Pseudomonas aeruginosa：implication of matrilysis and receptor cleavage [J]. PLoS One，2013，8（9）：E75708.

[17] Jayaseelan S，Ramaswamy D，Dharmaraj S. Pyocyanin：production，applications，challenges and new insights [J]. World J Microbiol Biotechnol，2014，30（4）：1159-1168.

[18] 潘婷婷，李鏞，劉嘉琳，等.銅綠假單胞菌感應系統基因表達與毒力因子的相關性分析[J].內科理論與實踐，2015， 10（4）：294-298.

[19] Welsh MA，Eibergen NR，Moore JD，et al. Small molecule disruption of quorum sensing cross-regulation in Pseudomonas aeruginosa causes major and unexpected alterations to virulence phenotypes [J]. J Am Chem Soc，2015， 137（4）：1510-1519.

[20] Longo F，Rampioni G，Bondì R，et al. A new transcriptional repressor of the Pseudomonas aeruginosa quorum sensing receptor gene lasR [J]. PLoS One，2013，8（7）：E69554.

（收稿日期：2018-10-24 本文編輯：金 虹）