鑒別診斷雞傳染性法氏囊病RT-PCR方法的建立

嚴紅亞，趙鶴庭,2，趙蓉，信愛國，常志順*

(1.云南省畜牧獸醫科學院 養禽與禽病研究所，云南 昆明 650224；2.洱源縣動物疫病預防控制中心，云南 洱源 671200)

雞傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease, IBD)是由傳染性法氏囊病毒(IBDV)引起，主要侵害雞淋巴組織，特別是法氏囊組織[1]。IBDV的核酸為線性雙股RNA，目前普遍認為影響該病毒抗原及毒力的變異主要發生在VP2基因，其編碼的結構蛋白是主要宿主保護性抗原，與病毒中和抗體的誘導和識別等有關。根據毒力差異，IBDV可分成超強毒株(very virulent IBDV, vvIBDV)、經典毒株(classical IBDV，cIBDV)、變異毒株(variant IBDV, vIBDV)和致弱毒株(疫苗株)。IBD主要造成雞的免疫抑制，引起雞死亡或者導致感染雞的免疫應答能力降低、抵抗力下降和生長抑制等，使其易受到其他病原的并發及繼發感染，給養雞業帶來巨大的損失。

快速檢測IBDV對該病的防控具有重要的意義。目前，國內 IBDV快速檢測方法主要有 RT-PCR[3]、熒光定量 RT-PCR 法[4]、雙抗體夾心 ELISA[5]和環介導等溫擴增技術(LAMP)[6]等分子生物學方法。本文建立了特異性檢測IBDV和區分IBDV超強毒株(vvIBDV)和經典毒株(cIBDV)的RT-PCR方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

傳染性法氏囊病活疫苗(B87株)購自湖南中岸生物藥業有限公司，雞白痢沙門氏菌、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒均為本實驗室分離鑒定保存，禽流感病毒H9血凝抗原購自哈爾濱維科生物技術開發有限公司。

1.2 主要試劑

病毒RNA提取試劑(RNAiso Plus)購自寶生物工程(大連)有限公司，病毒cDNA合成試劑盒(TransScript one-step gDNA cDNA synthesis Super Mix)購自天根生化科技(北京)有限公司。PCR試劑(2×High-Fidelity Master Mix)購自上海捷瑞生物工程有限公司，其他化學試劑均為國產分析純產品。

1.3 引物合成

IBD病毒VP2基因片段為高變異區，采用文獻報道的引物[2]，針對VP2基因建立IBDV通用檢測和區分毒株毒力強弱的RT-PCR方法(表1)。其中引物對IBDVF/IBDVR用于IBDV檢測基礎PCR擴增，引物對IBDVf/IBDVr用于IBDV檢測巢式PCR擴增；引物對vvIBDVF/vvIBDVR和引物對cIBDVF/cIBDVR分別用于區分IBDV超強毒株和經典毒株。引物由昆明碩擎生物科技有限公司合成。

1.4 病毒RNA提取和cDNA的合成

取200μL傳染性法氏囊病活疫苗原液，用RNAiso Plus試劑提取病毒總RNA，最終溶解于40mL RNase-Free ddH2O中，-70℃保存備用。取上述所提RNA進行反轉錄，反轉錄的體系為：5×gDNA Buffer 2μL、Total RNA 8mL,42℃孵育3min，置于冰上放置。10×King RT Buffer 2μL 、FastKing RT Enzyme Mix 1μL 、IBDV通用反轉錄引物為隨機引物，總體系為20μL；反應條件為42℃ 15min、95℃ 3min，合成的cDNA產物進行后續PCR擴增。

表1 引物信息

1.5 傳染性法氏囊病PCR檢測

以上述獲得的cDNA產物為模板，針對傳染性法氏囊病VP2基因高變區，建立IBDV檢測方法。PCR反應為25μL體系：2×High-Fidelity Master Mix 12.5 μL、ddH2O 10.5μL、IBDV VP2基因基礎引物(IBDVF/ IBDVR)或經典毒株引物(cIBDVF/cIBDVR)、超強毒株引物(vvIBDVF/ vvIBDVR)各0.5μL、cDNA模板1μL，混勻。擴增條件：94℃ 3min、94℃ 30s、58℃ 30s、72℃ 30s，35個循環；72℃延伸5min。巢式PCR以第一次基礎PCR產物為模板再進行PCR 擴增，巢式PCR引物為IBDVf/ IBDVr，擴增條件：94℃ 3min、94℃ 1min、60℃ 45s、72℃ 30s，35個循環；72℃延伸5min。反應結束后取5μL產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳觀察和成像系統拍照分析。

1.6 特異性測定

分別提取雞白痢沙門氏菌、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、禽流感病毒基因組，按上述方法進行擴增，驗證建立方法的特異性。

1.7 樣品檢測

取2份送檢的疑似傳染性法氏囊病樣品及臨床健康雞肛拭子樣品1份，按照RNA提取試劑盒說明書提取總RNA后，采用上述方法進行RT-PCR擴增，鑒定IBDV，擴增產物進行2.0% 瓊脂凝膠電泳分析。

2 結果

2.1 IBDV基礎PCR 檢測結果

提取病毒RNA，利用試劑盒通用檢測引物獲得病毒cDNA，針對IBDV VP2基因設計基礎PCR引物和巢式PCR 引物進行擴增，檢測IBDV。結果獲得679bp 目的條帶(見圖1)。表明該方法能夠檢測出IBDV，可以用于IBDV的臨床檢測。

1：IBDV B87毒株陽性； 2：陰性對照

2.2 IBDV巢式PCR 檢測結果

利用基礎PCR 所獲得的產物作為模板，進行巢式PCR 檢測。獲得預期471bp目的條帶(見圖2)。表明當樣品中病毒含量較少時，巢式PCR 可用于IBDV的檢測。

1：IBDV B87毒株陽性； 2：陰性對照

2.3 IBDV經典毒株和超強毒株的鑒別

提取病毒RNA，利用試劑盒通用檢測引物獲得病毒cDNA，針對IBDV超強毒株和經典毒株設計特異性引物進行擴增，結果獲得相應的目的條帶(見圖3)。表明可用該方法區分IBDV超強毒株和經典毒株。

1：經典毒株； 2：超強毒株

2.4 IBDV特異性檢測結果

對雞白痢沙門氏菌、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、禽流感病毒H9血凝抗原進行IBDV檢測，結果顯示上述病原檢測物特異性擴增產物，說明該方法對檢測IBDV具有特異性。

2.5 IBDV樣品基礎PCR檢測鑒定結果

用建立的方法檢測驗證IBDV樣品，通過基礎 RT-PCR檢測，結果顯示，疑似IBDV樣品基礎PCR可擴增出679bp預期條帶，來源于健康雞肛拭子樣品檢測結果為陰性，見圖4。

1、2：疑似IBDV臨床樣品； 3：健康雞肛拭子；4：陰性對照

用建立的巢式PCR方法檢測驗證IBDV樣品，結果顯示，IBDV疑似樣品均可擴增出471bp預期條帶，來源于健康雞肛拭子樣品檢測結果為陰性，見圖5。說明IBDV疑似樣品為傳染性法氏囊病陽性，健康雞肛拭子樣品為傳染性法氏囊病陰性。

1、2：疑似IBDV臨床樣品； 3：健康雞肛拭子；4：陰性對照

鑒定傳染性法氏囊病毒樣品經典毒株和超強毒株，結果獲得大小為137bp的經典毒株目的條帶(見圖6)，超強毒株條帶為陰性(結果未顯示)。說明IBDV陽性樣品為傳染性法氏囊病經典毒株。

1、2：IBDV陽性樣品； 3：陰性對照

3 討論

雞傳染性法氏囊病可直接引起雞只死亡，還可損傷病雞免疫系統，造成病雞抵抗力下降，易受到其他多種病原微生物的感染。快速診斷和鑒別IBDV是預防控制該病的重要手段。RT-PCR方法是從基因水平檢測IBDV，具有敏感性高、特異性強的特點。與常規瓊脂擴散試驗、病毒血清中和試驗等方法相比，檢測更快速、更準確[7-9]。用RT-PCR方法鑒定IBDV不需要增值病毒，在病毒含量較低時采用巢式PCR可以準確鑒定檢測結果，提高檢測效率。1999年陳紅英等[10]采用套式RT-PCR檢測IBDV，由于引物特異性不高等問題限制了在臨床上的運用和推廣。本實驗建立了一種快速準確鑒定IBDV的方法，針對IBDV的VP2基因設計兩對特異性引物，針對經典毒株和超強毒株分別設計一對引物，用于鑒定IBDV和區分經典毒株和超強毒株，并進行相關特異性、重復性等實驗。該方法具有較好的特異性和重復性，與禽類相關病毒、細菌不發生交叉反應，能夠運用于臨床上IBDV的快速檢測，為傳染性法氏囊病疫情的監測和控制提供了有效手段。