正畸加力過程中外周血和脾臟中炎性單核細胞比例和CD226分子表達水平變化

王憲 馬千里 金作林 陳麗華

正畸牙齒移動(OTM)和生理牙齒移動被認為是以破骨細胞和成骨細胞動態平衡引發骨重塑為特征的反應過程；而不同之處則在于正畸牙齒移動過程中牙齒移動的速度更快，正畸力引起的組織變化更加顯著和廣泛[1]。正畸力需要作用于牙周膜和牙槽骨才能啟動正畸牙齒移動這一反應。正畸力的大小、方向和持續時間等都會對牙齒移動的效果產生影響, 1951 年Reitan[2]的研究結果使人們開始重視“牙齒移動是一系列骨吸收及改建的過程”這一理論。而破骨細胞作為目前可以溶解骨組織的重要細胞參與了正畸牙齒移動過程中骨吸收及骨改建的過程。破骨細胞由單核/巨噬細胞而來，現已證明在體外誘導的情況下，單核細胞在M-CSF與RANKL的共同刺激下可以誘導分化為成熟的破骨細胞[3]，而在正畸過程中牙周膜內的基質細胞及成骨細胞所表達的RANKL和OPG等分子均參與了破骨細胞的分化和成熟過程[4-5]。但是這些分子的誘導作用首先都需要破骨前體細胞成功地從血管內皮細胞間遷出血管到達作用部位才能得以實現。單核細胞是骨髓來源的細胞，存在于外周血和脾臟，被認為是破骨細胞的前體[6]，正畸加力可以使脾臟和外周血中炎性單核細胞的比例在加力初期有所減少，但是加力7 d時炎性單核細胞比例恢復正常[7]，但是具體影響單核細胞比例變化的機制尚不明確。CD226分子是炎性單核細胞表面重要的分子標志[8]，參與炎性單核細胞的遷移和功能[9]，但其在正畸加力過程中炎性單核細胞表面表達水平未見報道。鑒于此，本研究以小鼠為實驗模型，在觀測正畸加力過程中小鼠脾臟和外周血中炎性單核細胞比例改變的基礎上，進一步觀測CD226分子表達水平的變化。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑

正畸用鎳鈦拉簧(上海埃蒙迪)；電子測力計(SF-5，浙江艾普)；0.1 mm結扎鋼絲(上海晨曦)；酸蝕劑(西湖巴爾)；EasyBond粘接劑、 Z350復合樹脂(3M， 美國)；開口器及可移動實驗平臺(自制)；光固化燈(LED.B，廣西啄木鳥)；戊巴比妥鈉(默克，德國)；流式熒光抗體(Biolegend，美國)；小鼠淋巴細胞分離液(達優，深圳達科為)； RPMI培養基(Hyclone， 美國)；體式顯微鏡(Leica，德國)。

1.2 實驗動物

6～8 周齡無特定病原體(SPF級)的雌性C57小鼠(空軍軍醫大學實驗動物中心提供)，體重18～20 g(飼養于第四軍軍醫大學基礎醫學院免疫教研室動物房)，提供消毒飼料及消毒飲用水。

1.3 小鼠牙齒正畸加力模型的建立

選擇雌性C57小鼠，隨機分為3 組(加力1 d組、加力3 d組和加力7 d組)，每組中分為實驗組及對照組(加力3 d組、加力7 d組各4 只， 加力1 d組中實驗組5 只，對照組3 只)。使用0.01 g/ml的戊巴比妥鈉對小鼠進行進行腹腔注射(回抽無血，避免傷及內臟)，注射量為1.5 ml。小鼠麻醉后將小鼠仰臥固定于實驗臺上，使用自制開口器打開小鼠口腔，充分暴露左側上頜第一磨牙，使用乙醇棉球清潔牙面后酸蝕牙面，酸蝕60 s后使用酒精棉球擦拭牙面，吹干至牙齒表面呈現白堊色，涂布粘接劑后光固化10 s；拉簧長度修建至4 mm，將一側第一圈彎折90°，另一側與0.1 mm結扎絲固定。將彈簧彎折側放置于第一磨牙上，使用適量粘接樹脂進行粘接，而后光固化40 s。相同方法在雙側切牙上粘接一“綠豆粒”大小的樹脂球，將結扎絲置于樹脂球兩側，與測力計連接；移動實驗平臺待測力計數值顯示為0.39 N時停止在此位置上進行結扎。術后喂以面包，每日早晚2 次觀察口內彈簧如出現脫落，及時重新進行粘接；加力7 d在3 d時再次對彈簧進行加力。

1.4 標本采集

小鼠在加力1、 3、 7 d后，摘除眼球法采集外周血于抗凝管中用以后續的流式細胞術檢測；之后將小鼠浸泡于70%乙醇溶液中5 min進行消毒，而后將小鼠置于解剖臺上分離獲得脾臟，采用研磨的方法獲得脾臟的單細胞，用于流式細胞術檢測； 迅速分離小鼠上頜骨，放入多聚甲醛固定液中固定24 h后取出小鼠上頜骨標本置于10% EDTA溶液中常溫進行脫鈣， 3 d換脫鈣液， 3 周后使用針刺法檢查脫鈣情況；脫鈣結束后將骨標本進行修整，僅保留小鼠左側上頜磨牙，而后進行包埋，石蠟切片進行免疫組化及HE染色。

1.5 流式細胞術檢測

加入小鼠淋巴細胞分離研磨獲得的小鼠脾臟單細胞懸液上放置1.5 ml RPMI培養基，在800 g下離心30 min(去剎車)，可見明顯的“白膜層”，使用彎頭滴管小心吸取白膜層細胞，注意勿將下層分離液吸出。使用5 ml流式洗液在1 000 r/min離心5 min， 2 遍后將細胞稀釋為10 ml，進行細胞計數，根據計數結果每個流式管中放入1 ×106個細胞進行檢測，每只小鼠設ISO(同型對照組)，FMO(熒光減一組)及EXP(實驗組)分別進行檢測，在每個流式管內加入相應流式熒光抗體，常溫下孵育20 min，洗滌兩遍后將細胞稀釋至適宜濃度進行檢測。每管中加入外周血100 μl， 分組同脾臟，在每個流式管內加入相應流式熒光抗體，常溫下孵育20 min后每管中加入1 ml紅細胞裂解液，裂解紅細胞20 min(如20 min裂解不徹底可再次裂解)，而后使用流失洗液清洗2 遍后進行檢測。

1.6 HE染色

常規HE染色封片， 光鏡下觀察小鼠第一磨牙牙根近遠中根的不同部位來確定是否有破骨細胞生成。

1.7 免疫熒光染色

常規染色封片， 熒光顯微鏡下觀察小鼠第一磨牙牙根近遠中根的不同部位破骨細胞生成情況。

1.8 統計方法

應用SPSS16.0統計軟件(SPSS Inc，Chicago，USA)對所取得的數據資料進行統計分析，所取得的計量資料均選擇兩樣本Kolmogorov-Smirnov檢驗(K-S檢驗)進行統計對比分析， 檢驗水平取0.05，雙側檢驗。

2 結 果

2.1 成功建立小鼠牙齒正畸移動模型

模型建立期間均未出現拉簧脫落的情況，加力1、 3、 7 d后均可在體式顯微鏡下觀察到小鼠上頜第一磨牙遠中存在間隙，證明小鼠上頜第一磨牙近中移動有效，實驗模型建立成功(圖 1A)；在體式顯微鏡下進行拍照，測量間隙，并將數據進行統計學分析，加力1 d時小鼠第一磨牙近中移動(50.76±7.483) μm，加力3 d時小鼠第一磨牙近中移動(85.95±4.532) μm，而加力7 d時小鼠第一磨牙近中移動(121.1±7.468) μm,組間比較P<0.05。 將小鼠上頜骨標本制作切片后行免疫熒光染色可見在加力7 d時， 小鼠近中根牙周膜近中側出現破骨細胞(圖 1B)。

2.2 正畸加力后脾臟及外周血中的炎性單核細胞比例和CD226分子表達水平發生變化

取小鼠脾臟和外周血單個核細胞進行流式細胞術檢測， 檢測發現脾臟及外周血中的炎性單核細胞比例均在正畸加力過程中出現了變化(圖 2A、2B)。 在脾臟中加力1 d時實驗組中炎性單核細胞較對照組無明顯差異， 加力3 d時實驗組中的炎性單核細胞(2.88%)比例較對照組(0.93%)中明顯增高，而到加力7 d時實驗組中的炎性單核細胞比例仍較對照組無明顯差異， 在加力3 d時和加力7 d時脾臟炎性單核細胞表面CD226分子的平均熒光強度分別為5941和4997，均低于對照組(9758和8770)(圖 3A、3B)，在外周血中可見加力1 d時外周血中的炎性單核細胞比例(1.16%)較對照組(2.46%)出現了明顯的下降，而在加力3 d時外周血中的炎性單核細胞比例(9.02%)較對照組(2.23%)

圖 1 第一磨牙移動和牙周膜中破骨細胞生成

(×25)

Fig 1 The movement of first molar and the osteoclasts in periodontal ligaments

圖 2 加力不同天數小鼠脾臟和外周血中炎性單核細胞比例變化

Fig 2 The ratio of inflammatory monocytes in the spleen and the peripheral blood of mouse in different periods

出現了明顯的升高，而在加力7 d時外周血中的炎性單核細胞比例(6.97)與對照組(1.81%)相比仍增高，但相比加力3 d組比例有所減少(圖 2B)。相較于對照組(6854和10078)，外周血中的炎性單核細胞表面CD226的平均熒光強度也在加力3 d(4302)及加力7 d(6766)時出現降低(圖 3B)。在加力1、 3、 7 d時炎性單核細胞中CD226+細胞比例均無明顯差異(圖 3C)。

2.3 小鼠正畸加力后牙周組織的變化及破骨細胞生成

取對照組、加力1 d、加力3 d和加力7 d組小鼠標本制作石蠟切片行HE染色，光鏡下觀察，發現加力1 d時小鼠第一磨牙近中側牙周膜間隙變窄，但未見明顯破骨細胞；在加力3日時可見在近中側牙周膜處出現破骨細胞(1.5±0.29)；加力7 d時可見在近中側牙周膜處出現更多的破骨細胞(2.5±0.29)(圖 4A)，并隨著加力時間的延長破骨細胞的數量有所增加(圖 4B)。

3 討 論

破骨細胞在正畸治療過程中具有重要的功能，因此對于破骨細胞的研究一直是正畸領域的熱點問題。目前為止正畸過程中牙周膜內破骨細胞的分化增殖過程已基本清晰，當正畸力加載于牙周膜，壓力側的牙周膜被壓縮，同時伴隨牙周膜血管的壓縮，造成局部供血不暢，形成局部的氧缺乏微環境。這將引發局部的炎癥反應，炎癥因子如IL-1β、TNFα、PGE2、CSF-1、VEGF等大量分泌，這些因子的分泌使得局部血管通透性改變，大量成骨前體細胞募集至牙周膜，在局部成骨細胞和基質細胞表達的RANKL刺激下使得破骨前體細胞逐漸分化為破骨細胞，從而產生破骨作用[10-12]。有文獻表明，CD226分子作為炎性單核細胞表面一種高表達的分子在單核細胞遷移出血管內皮的過程中發揮重要作用[9,13]，因此本實驗通過觀測正畸加力過程中小鼠體內炎性單核細胞比例和CD226分子表達水平的動態變化，旨在進一步探索和明確正畸加力過程中的細胞和分子機制。

Zeng等[7]在研究正畸力對于炎性單核細胞的影響時發現，在加力初期不論是脾臟還是外周血中，炎性單核細胞的比例均下降， 而在后期出現回升, 相較于Zeng等的研究， 本實驗發現， 在小鼠牙齒正畸加力模型建立1 d時，只有外周血中的單核細胞比例發生了下降，而脾臟和炎性單核細胞表面CD226分子表達水平均無明顯變化。正畸加力初始階段，組織反應需要在一定的時間內才能啟動，加力1 d時，牙周膜局部的變化只能招募外周血中的單核細胞募集至作用部位，但是脾臟中的單核細胞受到加力影響的效果尚未體現，骨髓中的新生單核細胞尚未補充至外周血及脾臟；而在加力3 d時脾臟及外周血中的單核細胞數量有所增加，同時CD226分子表達降低。有文獻表明脾臟中貯存有大量的炎性單核細胞， 在炎癥發生時可以快速補充至外周血，進而抵達作用部位[14]，而脾臟中的炎性單核細胞由骨髓中的單核細胞遷移而來[15]，在加力3 d時由于力量的持續刺激，脾臟中原有的炎性單核細胞補充至血液中，同時骨髓中產生的炎性單核細胞大量補充至外周血及脾臟，使得脾臟和外周血中炎性單核細胞比例均增加。而CD226分子表達水平降低可能是由于原本高表達CD226分子的炎性單核細胞已經移動至外周的作用部位所引起。加力7 d時，脾臟中炎性單核細胞比例與對照組無統計學差異，而CD226分子的表達出現降低可能是由于加力7 d時骨髓新生的炎性單核細胞已經通過血液補充至脾臟，但是由于血中炎性單核細胞的CD226分子表達低，因此補充至脾臟的炎性單核細胞表面CD226分子表達水平依舊較對照組降低。由于本實驗采用的拉簧和流式細胞術檢測方法與Zeng等[7]研究中所使用實驗條件均不同，可能實驗結果存在差異，故在后期實驗中將加大樣本量，確保實驗結果的準確性。

圖 3 加力不同天數小鼠脾臟和外周血中CD226+炎性單核細胞比例和平均熒光強度變化

Fig 3 The ratio and the MFI of CD226+inflammatory monocytes in the spleen and the peripheral blood of mouse in different periods

圖 4 加力不同天數小鼠第一磨牙近中根牙周膜中破骨細胞數量變化

正畸力的加載可以影響外周血和脾臟中炎性單核細胞比例的變化，同時加力后炎性單核細胞表面CD226分子的表達水平也存在變化，說明在正畸過程中CD226分子極有可能參與了正畸力作用下的牙齒移動過程。CD226分子對正畸牙齒移動過程產生影響的細胞和分子機制尚須進一步深入探討。