Axl抑制劑R428誘導口腔鱗癌Cal27細胞自噬的研究

朱鈞一 唐清明 陳莉莉 賈玉林

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤，其5 年總體生存率約為60%左右[1]。盡管綜合序列治療有效提高了口腔鱗癌的局部控制率，但臨床晚期的口腔鱗癌患者生存率仍無明顯改善。近年來，隨著腫瘤基礎研究和轉化醫學的不斷發展，分子靶向治療為口腔鱗狀治療提供了新的思路。Axl 激酶屬于受體酪氨酸激酶TAM家族，能與配體Gas 6結合而激活其酪氨酸激酶活性，進而活化其下游的信號通路，與腫瘤細胞增殖、血管生成、轉移等惡性行為密切相關[2]。近來研究發現，Axl在口腔鱗癌中高表達，且有望成為口腔鱗癌新的分子治療靶點[3]。

自噬是真核細胞降解受損細胞器或蛋白，維持內環境穩定的高度保守的生物學過程，在多種生理病理學過程中起著重要作用[4]。自噬與腫瘤的發生和發展具有重要關系，并且為腫瘤治療提供了新思路，是目前國際上腫瘤研究中的熱點。目前關于靶向Axl對于腫瘤細胞自噬的研究尚未見報道。本研究選取口腔鱗癌細胞系Cal27為研究對象，探究Axl特異性分子抑制劑R428對口腔鱗癌細胞系細胞活力的影響，并進一步研究R428誘導口腔鱗癌細胞的自噬現象，及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞培養 口腔鱗癌細胞系Cal27(ATCC， 美國)， Cal27細胞使用含有10%胎牛血清(Gibco，美國)和1%青霉素-鏈霉素(Hyclone，美國)的DMEM高糖培養基(Hyclone，美國)培養，隔天換液，每隔3 天傳代1 次，細胞培養于37 ℃和5% CO2濃度的細胞培養箱內。

1.1.2 主要試劑 Axl抑制劑R428(Selleck，美國)；自噬抑制劑3-MA(Selleck，美國)；自噬抑制劑CQ、 活性氧清除試劑NAC、 MTT、 DMSO、 G418(Sigma，美國)； 細胞蛋白裂解液RIPA(上海碧云天)；BCA蛋白定量試劑盒(上?？党缮?；DNA轉染試劑(Biotool, 上海)；活性氧檢測試劑盒(Solarbio， 北京)。

1.2 方法

1.2.1 MTT法測定細胞活力 收集對數期Cal27細胞，調整細胞懸液濃度為50 000 個/ml，在96孔板中每孔加入100 μl細胞懸液(每孔5 000 個細胞)，接種細胞后12 h(此時Cal27細胞已良好貼壁)使用不同濃度的藥物處理Cal27細胞24 h。 24 h后去除原有培養基并加入含10% MTT的DMEM培養基，培養4 h后，去除培養液后加入DMSO溶解紫色結晶，使用酶標儀讀取570 nm吸光度并計算細胞活力。

1.2.2 透射電鏡 收集的細胞團塊經2.5%戊二醛固定過夜， 1% OsO4處理后入梯度酒精脫水，環氧樹脂包埋，切成65 nm超薄切片， 2%醋酸鈾酰染色， Hitachi H-600型透射電鏡觀察。

1.2.3 GFP-LC3免疫熒光檢測 使用DNA轉染試劑將GFP-LC3質粒轉染Cal27細胞后，利用G418篩選細胞。轉染結束后，使用PBS清洗細胞兩遍，更換為新鮮DMEM培養基做進一步處理。使用熒光顯微鏡觀察Cal27細胞的LC3熒光，按照先前文獻記載方法對細胞的LC3熒光點狀結構進行計數統計[5]。

1.2.4 Western Blot Cal27細胞接種于60 mm培養皿，按實驗分組處理24 h后提取細胞總蛋白，BCA法測定總蛋白濃度。經SDS-PAGE、轉膜、封閉、一抗4 ℃ 過夜孵育、二抗室溫1 h孵育等過程后，顯影成像分析。

1.2.5 細胞內活性氧檢測 將細胞接種于24 孔板中，完成加藥處理細胞后，加入活性氧檢測試劑盒中的DCFH-DA熒光探針， 37 ℃孵育30 min后，PBS洗滌細胞3 次， 加入新鮮培養基，放入熒光酶標儀中進行熒光檢測[6]。

1.3 統計學分析

2 結 果

2.1 Axl抑制劑R428對Cal27細胞活力的影響

MTT細胞活力實驗結果表明，Axl抑制劑R428處理口腔鱗癌Cal27細胞24 h后能顯著降低其細胞活力，且R428對Cal27細胞的殺傷作用呈劑量依賴性(圖 1)。R428的半抑制藥物濃度(IC50)為1.317 μmol/L，后續實驗選擇0.5、 1、 1.5 μmol/L作為R428的藥物作用濃度。

圖 1 不同濃度的R428對Cal27細胞活力的影響

2.2 Axl抑制劑R428對Cal27細胞自噬活動的影響

結果表明，與對照組相比(圖 2A)，R428處理組的細胞內呈現出自噬泡(autophagic vacuoles)累積(圖 2B)，自噬泡體積較大，占據了細胞質大量空間(圖 2B)，且自噬泡內有較多細胞內容物(圖 2C)。R428處理Cal27細胞后，細胞內的GFP-LC3熒光點數目明顯增多(圖 3)，且GFP-LC3的熒光增多效應與R428藥物作用濃度呈正相關(圖 4)。Western blot實驗表明，R428能夠劑量依賴性地引起Cal27細胞中Atg5(自噬正向調控分子)的表達升高和P62(自噬底物)的表達降低(圖 5)。這些結果均表明Axl抑制劑R428能夠導致Cal27細胞自噬水平升高。

2.3 R428誘導的細胞自噬對Cal27細胞活力的影響

實驗發現，與R428單獨處理Cal27相比(1 μmol/L R428處理Cal27細胞24 h)，使用自噬抑制劑3-MA預處理(4 mmol/L 3-MA預處理細胞1 h)Cal27后其細胞活力明顯降低(圖 6)。與此同時， 使用另一種抑制劑CQ阻斷自噬(10 μmol/L CQ預處理細胞1 h)也能夠增強R428對Cal27的細胞殺傷作用(圖 6)。

圖 2 Cal27細胞自噬

(TEM， A、 B: ×1 500， C： ×3 000)

Fig 2 Autophagy of Cal27 cells

(TEM， A, B: ×1 500， C： ×3 000)

圖 3 Cal27細胞自噬

(免疫熒光顯微鏡, ×40)

Fig 3 Autophagy of Cal27 cells

(IFM, ×40)

圖 4 Cal27細胞內LC3熒光點數目 圖 5 R428對Cal27細胞自噬相關蛋白表達的影響

Fig 4 LC3 fluorecent plot in Cal27 cells Fig 5 Autophagy related protein expression of Cal27 cells

2.4 細胞內活性氧在R428誘導的Cal27細胞自噬中的作用

細胞內活性氧(reactive oxygen species, ROS)與自噬關系密切而復雜。本研究結果表明，Axl抑制劑R428能顯著升高Cal27細胞內ROS水平，且R428對ROS的刺激作用呈濃度依賴性(圖 7)。使用活性氧清除試劑NAC來降低細胞內ROS水平， 結果表明，NAC不僅能有效降低細胞內ROS水平(圖 7)，而且能夠顯著抑制R428誘導的細胞內LC3熒光聚集，表明NAC能夠抑制R428誘導的細胞自噬(圖 7)。此外， R428單獨作用能有效殺傷Cal27細胞，而活性氧清除試劑NAC與R428聯合作用能進一步增強其細胞殺傷效果(圖 7)。這些結果提示ROS對R428誘導的Cal27細胞自噬發揮促進作用。

3 討 論

口腔鱗癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，其惡性程度較高，生長快，浸潤性強， 容易沿頸部淋巴結途徑轉移，晚期口腔鱗癌患者常因局部復發和頸部淋巴結及全身轉移而導致死亡[7]。化療作為目前廣泛應用于口腔鱗癌手術前后的重要輔助治療，是口腔鱗癌綜合序列治療的重要環節。隨著腫瘤細胞生物學和分子生物學的不斷發展進步，分子靶向治療在口腔鱗癌治療中的價值和意義逐漸凸顯出來，成為未來臨床治療發展的重要突破方向[8]。近年來研究發現，Axl 激酶作為受體酪氨酸激酶 TAM 家族的一員，在腫瘤生長、轉移和耐藥性等生物學行為中發揮重要作用，有望成為惡性腫瘤治療一個新的分子靶點[9]。與此同時，研究表明Axl不僅在口腔鱗癌中表達明顯升高，且體外細胞實驗和人源性腫瘤組織異種移植實驗均證實針對Axl的分子靶向藥物在口腔鱗癌治療中具有重要價值[3]。R428作為Axl的一種特異性抑制劑，能夠阻斷Axl的催化和促癌活性，是目前研制出針對Axl最有效的分子靶向藥物之一[10]。然而，Axl抑制劑R428用于口腔鱗癌治療的作用機制較為復雜，其藥理機制仍不明確。

圖 6 R428誘導的細胞自噬對Cal27細胞活力的影響

Fig 6 The effects of R428-induced autophagy on the viability of Cal27 cells

圖 7 細胞內活性氧在R428誘導的Cal27細胞自噬中的作用(與空白對照組相比，①P<0.01，②P<0.001; 與R428單獨處理組相比, ③P<0.001)

Fig 7 The role of intracellular ROS in R428-induced autophagy of Cal27 cells (versus the blank group，①P<0.01，②P<0.001； versus the R428 treatment group, ③P<0.001)

自噬是真核細胞普遍存在的生命現象。在自噬過程中，細胞通過形成雙層膜樣結構包裹受損或變性的蛋白質和細胞器形成自噬體，再與溶酶體融合形成自噬溶酶體，最后通過溶酶體降解其所包裹的內容物并加以回收利用，從而維持細胞內環境的穩定和能量代謝的平衡[4]。大量研究表明，自噬在腫瘤的發生、發展及放化療抵抗中亦扮演著至關重要的角色[11]。在藥物作用等應激條件下，自噬通常具有“兩面性”特征：在一些情況下(如DNA損傷或它莫西芬等抗激素藥物作用)自噬可以發揮促生存作用，抑制細胞死亡，而在另一些情況下(如Bcl-2或PKC蛋白抑制劑作用)，自噬可以發揮促死亡作用，引起自噬性細胞死亡[12]。本研究發現，Axl抑制劑R428作用于口腔鱗癌Cal27細胞后，能明顯抑制其細胞活力，導致細胞死亡； 借助透射電鏡、LC3免疫熒光和Western blot多種檢測手段，發現R428在誘導Cal27細胞死亡的同時，還可以顯著升高Cal27的細胞自噬水平，這表明R428對Cal27細胞具有促自噬作用。為了探究R428誘導的自噬對Cal27細胞存亡的作用，本研究使用2 種常用抑制劑阻斷了Cal27細胞自噬，結果表明抑制細胞自噬可增強R428對口腔鱗癌細胞的殺傷作用，這提示聯合應用R428和自噬抑制藥物可能成為Axl分子靶向治療的新策略，增強其對口腔鱗癌的抗腫瘤作用。

細胞內ROS是機體內有氧代謝產生的一類活性含氧化合物的總稱，能夠調控多種細胞生理和病理反應，在維持細胞穩態和細胞信號轉導方面具有重要作用[13]。近年來一系列研究表明，細胞內ROS可作為一種細胞內信號分子參與細胞自噬的激活[14]。本研究發現，R428能夠升高Cal27細胞內ROS水平。進一步研究表明，使用活性氧清除試劑NAC阻斷細胞內ROS產生后，R428誘導的細胞自噬水平明顯降低，且細胞活力亦明顯降低，這提示細胞內ROS可能是R428誘導的細胞自噬信號通路中的一個正向調控信號分子(圖 8)。綜合R428對Cal27細胞的效應，本研究發現R428在誘導口腔鱗癌細胞死亡的同時，還可以激活口腔鱗癌細胞的防御反應——細胞自噬，而細胞內ROS對自噬發揮正向調控作用(圖 8)。

圖 8 R428誘導的細胞自噬作用示意圖

綜上所述，本研究首次發現Axl抑制劑R428可同時誘導口腔鱗癌細胞死亡和細胞自噬，抑制細胞自噬可增強R428對口腔鱗癌細胞的殺傷作用，針對Axl的分子靶向藥物R428有望成為口腔鱗癌新的治療選擇。