PTH加速下頜升支截骨術后正畸牙移動過程中RANKL/OPG的表達

李耀 唐正龍 陳小燕 王冬香 高瓊

近年來，“手術優先”(Surgery-first approach，SFA)在快速改善患者面型縮短治療療程方面引起學者們關注，SFA可能通過術后激活成骨和破骨細胞相關因子來調節牙槽骨的轉換率，加速正畸牙的移動，從而縮短正畸療程[1-2]。正畸牙移動過程中牙周骨組織的改建受多種因素調節。甲狀旁腺激素(parathyroid honmone, PTH)能保持血液中血鈣的平衡，并參與骨組織的合成及分解代謝過程[3]。近年研究發現，應用PTH可通過調節牙周組織的轉換率來促進正畸牙的移動，然而其調控機制尚不明確[4-5]。

正畸牙的移動過程中，同時受到很多成骨細胞和破骨細胞相關因子的參與，其中破骨細胞核因子κB受體活化因子配體(receptor activator nutear factor kappa-B ligand，RANKL)及骨保護因子(osteoprotegerin，OPG)是細胞外調節骨吸收的關鍵因子[6-7]。研究發現RANKL和OPG在正畸牙移動期間表達增加，表明它們在牙周組織的重建過程中發揮重要作用[8-9]。

實驗通過建立兔下頜升支截骨和下頜第一磨牙正畸移動模型，術后間歇性注射PTH，觀測牙移動速度，檢測RANKL 和OPG在牙周組織中的表達，探討PTH在正頜手術后加速正畸牙移動的分子生物學機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

選用48 只6 個月齡的SPF級新西蘭大耳白兔(貴州醫科大學實驗動物中心)，雌雄不限，體重(2.5±0.1) kg。隨機分成實驗組和對照組，每組24只。對照組頸部隔日皮下注射生理鹽水1 ml，實驗組隔日皮下注射 20 μg/kg rhPTH(Tocris公司, 英國)，各組分別于牽牙第5、 7、 14、 21 d時處死6 只實驗動物。

1.2 建立兔下頜升支截骨和正畸牙移動模型

全麻下于兔右側下頜骨下緣作長約2 cm皮膚切口，切開皮膚、皮下組織、肌肉至骨面，切開骨膜，剝離下頜骨外側骨膜，于下頜角前區沿下頜骨升支至乙狀切跡做一弧形截骨線，截骨后在下頜下緣和升支后緣用鈦板(寧波慈北醫療器械有限公司)作堅固內固定。在下頜兩中切牙和術側下頜第一磨頸部中下1/3處制備一條固位溝，用0.2 mm的正畸結扎絲將 N-T拉簧(直徑 0.1 mm)固定于下頜中切牙和下頜術側第一磨牙之間，制作成下頜第一磨牙近中移動正畸模型(圖 1)。術后第一天牽引第一磨牙近中移動，調拉簧拉力使正畸牽引力值約0.78 N(圖 1)。

圖 1 下頜升支截骨術+正畸牙移動模型

Fig 1 Orthodontic models of mandibular first molar movement after mandibular ramus osteotomy

1.3 正畸牙移動速度測量

用硅橡膠印模材料取術側下頜牙模型，測量各時期第一磨牙牙冠中點與第二磨牙牙冠中點的距離。并計算出牙齒平均移動速度(mm/d)。

1.4 組織獲取及處理

各組實驗動物處死后，截取含下頜第一磨牙及周圍牙周組織的骨塊，其中3 只用4%多聚甲醛固定24 h， 20%乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣4周后常規石蠟包埋。標本沿牙體長軸，按施力方向的近遠中向連續切取5 μm組織學切片分別行HE染色、破骨細胞染色和免疫組化染色；另3 只用RNAlater液保存，用于實時熒光定量PCR檢測。

1.5 免疫組織化學檢測RANKL和OPG表達

用免疫組織化學法檢測正畸牙壓力側牙周組織中OPG和RANKL蛋白的表達(武漢博士德生物工程有限公司)。每張切片選擇5 個視野，經攝像后存于Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統中，計算并比較各組壓力側OPG和RANKL蛋白平均吸光度值(A值)。

1.6 實時定量PCR檢測RANKL mRNA和OPG mRNA表達

截取兔下頜第一磨牙壓力側近牙冠1/3處3 mm×3 mm×3 mm的牙槽骨組織，在液氮的中磨碎后取約1 mm3組織，磁珠法提取總RNA。取總RNA 13 μl，逆轉錄(Transcript First Strand cDNA Synthesis Kit， Roche, 美國)成cDNA， -20 ℃保存。取上下游引物各1 μl、 cDNA模板1 μl混合于反應管，添加 5 μl熒光染料SYBR Green I Master(Roche, 美國)，加雙蒸水補成10 μl反應體系。將所有反應管放入熱循環儀中(BIO-RAD)，設定熱循環儀反應條件(95 ℃ 5 min, 95 ℃ 10 s， 58 ℃ 20 s， 72 ℃ 30 s， 45 個循環)。 在60～95 ℃同時對目的基因及內參基因進行溶解曲線分析。以對照組為準，采用2-ΔΔct法進行數據的定量分析，得出各樣本RANKL mRNA及OPG mRNA相對表達量。RANKL、 OPG qPCR引物由上海生工生物工程有限公司設計和合成(表 1)。

表 1 引物基因序列

1.7 統計學分析

應用SPSS 23.0軟件對數據進行單因素方差分析，以P<0.05作為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 正畸牙移動速度的比較

術后21 d內實驗組下頜第一磨牙的移動速度均大于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。且2 組在第7 天正畸牙移動速度都達到最快，隨后2 組正畸牙移動速度均減慢(表 2)。

表 2 各組移動牙速度 (mm/d)

Tab 2 The speed of tooth movement

(mm/d)

2.2 牙周組織形態學觀察和破骨細胞計數結果

在正畸力牽引第5天時實驗組和對照組壓力側牙周間隙變窄，膠原纖維排列紊亂，可見多個破骨細胞位于牙槽骨表面的骨吸收陷窩內；張力側牙周韌帶增寬，細胞成分增多。在正畸力牽引第7天時，牙槽骨改建活躍，壓力側骨吸收陷窩進一步增大、增深，破骨細胞數目達到高峰，且實驗組較對照組明顯(P<0.05)(圖 2)；張力側牙周韌帶進一步增寬，可見成骨反應。在正畸力牽引第14 天和21 天時，實驗組和對照組壓力側骨破骨細胞逐漸減少；張力側部分骨小梁排列成片狀，新骨成骨厚度進一步增加。

圖 2 術后牽牙第7 天時實驗牙壓力側組織形態

(HE, ×100)

Fig 2 Morphology of periodontal tissues of the tested tooth on the compression side 7 d after treatment

(HE, ×100)

電鏡觀察下頜第一磨牙壓力側牙根1/3以上的破骨細胞數目，發現實驗組明顯多于對照組(P<0.05)， 2 組同時在第7天達到峰值(圖 3、 表 3)。

2.3 RANKL/OPG在正畸牙壓力側牙槽骨中的表達

RANKL陽性表達定位于牙周組織成骨細胞、破骨細胞的胞漿內。加力5～7 d時，壓力側牙槽骨中RANKL的表達水平隨時間的增加而增加，第7 天時平均吸光度值最大，隨后逐漸減弱(圖 4)。實驗組染色強度高于對照組(P<0.05)(表 4)。OPG陽性表達定位于新生骨小梁周圍的成骨細胞和成纖維細胞的胞漿內(圖 5)。加力21 d內，實驗組染色強度均低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)(表 5)。加力7 d時陽性表達達到峰值，隨后逐漸下。

2.4 RANKL/OPG mRNA在正畸牙壓力側牙槽骨中的表達

圖 3 術后牽牙第7、 14 天時下頜第一磨牙壓力側破骨細胞

(TRAP, ×200)

Fig 3 Osteoclasts on the compression side of periodontal tissues 7 and 14 days after operation

(TRAP, ×200)

圖 4 術后牽牙第7 天時 RANKL在下頜第一磨牙壓力側牙周組織區域的表達

(免疫組化染色, ×400)

Fig 4 Comparison of RANKL expression on the compression side 7 days after operation

(Magnification, ×400)

Tab 4 RANKL expression on the compression side

(A值，

圖 5 術后牽牙第7 天 OPG在下頜第一磨牙壓力側牙周組織區域的表達

(IHC, ×400)

Fig 5 OPG expression on the compression side on 7 d after operation

(ICH, ×400)

Tab 5 OPG expression on the compression side

(A值，

壓力側牙槽骨組織中的RANKL和OPG mRNA表達均在術后加力第5～7 天有微弱增加，至第7 天達最高峰，此后逐漸減少。且實驗組RANKL mRNA的表達高于對照組(P<0.05)。表明正畸牙壓力側牙周組織中存在較活躍的破骨活性，有利于正畸牙的快速移動(圖 6)。而壓力側OPG mRNA的表達結果相反，對照組OPG mRNA表達高于實驗組(P<0.05)(圖 6)。反應了對照組壓力側成骨活動較實驗組強，使對照組正畸牙移動速度低于實驗組。

3 討 論

手術優先正頜外科可使骨性牙頜面畸形患者的面型在早期得到明顯的改善，縮短療程，而且能通過激活相關骨改建因子來調節牙槽骨的代謝，促進正畸牙的移動[10-11]。 長期以來學者們在不斷探索加速正畸牙移動的方法和技術，除了一些手術方法和物理輔助方法外[12-14]，近來相關研究表明PTH作為一種重要的骨代謝調節激素，主要通過誘導牙槽骨的代謝來影響正畸牙的移動[15]，然而PTH對正畸牙移動的機制尚不明確。本研究設想在下頜升支截骨術后間歇性應用PTH可通過加速牙槽骨的代謝及轉換水平，從而進一步加速正畸牙的移動。研究結果顯示，應用PTH后實驗組下頜第一磨牙近中移動速度快于對照組，實驗組壓力側牙周組織中破骨細胞數量增加，說明實驗組術后給予PTH加速了牙周骨組織改建，從而使正畸牙移動加速。

圖 6 壓力側RANKL mRNA及OPG mRNA表達

Fig 6 Relative expression of RANKL mRNA and OPG mRNA on the compression side

PTH對骨重建的作用會受到給藥方式的影響，連續注射甲狀旁腺激素主要產生分解代謝效應，而間斷注射則主要導致合成代謝作用[16]。Soma等[4]通過建立鼠上頜正畸牙移動模型，持續應用10 mg PTH，結果顯示應用PTH組正畸牙壓力側破骨細胞數目大于對照組，且加快了正畸牙移動，而間隙性應用PTH沒有加速正畸牙的移動。Salazar等[17]研究顯示，對卵巢切除術后骨質疏松大鼠應用甲狀旁腺激素(30 μg/kg·d)皮下注射后，在第7 天時正畸牙移動速度快于未行卵巢切除術的對照組，且各組間正畸牙牙周膜間隙和破骨細胞數量沒有統計學差異。本研究模擬下頜升支正頜外科截骨手術，術后間歇性皮下注射20 μg/kg PTH，結果顯示實驗組正畸牙的移動速度快于對照組。說明在下頜升支截骨術后應用20 μg/kg PTH可加速正畸牙移動，但最適的效量關系任需進步一探索。

正畸牙的移動過程中成骨和破骨細胞因子的相互作用，最終導致壓力側骨吸收和張力側骨形成。PTH作為體內重要的骨代謝調節激素，既能促進骨形成，又能促進骨吸收，具有雙重調節作用。Li 等[5]研究外源性間歇性應用PTH后大鼠上頜正畸牙移動速度快于對照組，PTH通過RANKL結合于破骨細胞前體的表面，經一系列的級聯反應和信號傳導，刺激破骨細胞形成和骨吸收，同時抑制成骨細胞的活性，而成骨細胞及破骨細胞的相互作用是骨改建的關鍵，在牙槽骨重建過程中RANKL和OPG為其關鍵的調控因子。RANKL與破骨細胞核因子κB受體激活蛋白(receptor activator of NF-κB，RANK)結合，誘導破骨細胞的形成和活化。多種骨吸收細胞因子和激素，通過不同的信號機制，都匯合于上調RANKL的表達。同時RANKL具有與OPG結合的能力，OPG競爭性的與細胞膜表面的RANKL結合，抑制RANKL誘導破骨細胞形成，從而減少骨吸收[18-19]。Soma 等[4]研究發現，短期間斷性注射PTH可通過提高牙槽骨轉換率從而加速正畸牙的移動。本實驗通過蛋白水平和分子水平來檢測兔下頜升支截骨術后正畸牙壓力側不同時期RANKL及OPG的表達情況。結果發現，實驗組壓力側牙槽骨中RANKL表達高于對照組，反應了實驗組正畸牙壓力側牙周組織中存在較強的破骨細胞活性，加速了壓力側牙槽骨的分解代謝，有利于正畸牙的快速移動。而壓力側OPG的表達結果則相反，對照組OPG表達高于實驗組，反應了對照組壓力側成骨活動較實驗組強，一定程度上使對照組正畸牙移動速度低于實驗組。

應用外源性PTH可以促進破骨細胞的增生和分化，提高正頜術后正畸牙的移動。其可能的作用機制是在正頜術后PTH可通過增加RANKL表達，抑制OPG的表達，加速骨代謝及骨轉換水平，從而促進下頜正畸牙的移動。