口腔鱗狀細胞癌中RAF激酶抑制蛋白的表達及其與臨床特點的相關(guān)性

包凡 董菲 劉娟

口腔癌為最常見的頭頸部惡性腫瘤，主要發(fā)生在口腔黏膜如舌、頰、硬腭、牙齦等處。90%以上的口腔癌是鱗狀細胞癌(Oral Squamous Cell Carcinoma，OSCC)，口腔鱗狀細胞癌經(jīng)常發(fā)生侵襲和遠處轉(zhuǎn)移[1]，是一種惡性程度較高的腫瘤。

Raf-1激酶調(diào)控著細胞的生長、增殖以及分化，過度活化的Raf-1激酶會促近腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Raf激酶抑制蛋白(Raf kinase inhibitor protein,RKIP)是一種Raf-1激酶的抑制劑，屬于磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白(phosphatidylethanolamine-binding protein,PEBP)家族成員之一。RKIP能夠結(jié)合Raf-1從而抑制Raf-1介導(dǎo)的細胞增殖的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[2], 同時還可以調(diào)控G蛋白偶聯(lián)受體信號通路和NF-κB信號通路[3]。RKIP表達喪失或減少與很多惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),可以作為一種新的腫瘤標志物。研究證實Raf激酶抑制蛋白在肺癌[4]、胃癌[5]、子宮頸癌[6]、卵巢癌[7]、鼻咽癌[8]、胰腺癌[9]等多種惡性腫瘤中表達減少甚至消失,并且與腫瘤的浸襲和遠處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。RKIP表達缺失往往意味著腫瘤的惡性程度較高,遠處轉(zhuǎn)移的可能性較大，有學(xué)者認為RKIP可以作為腫瘤基因治療的新靶點。因而，本研究通過檢測RKIP在口腔癌組織以及非腫瘤組織的表達情況，評估了RKIP在口腔癌患者診療中的臨床價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究報經(jīng)醫(yī)院倫理委員會通過，收集云南省一院2014-01～2016-07病理科病理蠟塊，其中30 例口腔黏膜白斑、 50 例OSCC組織和50 例對應(yīng)的癌旁正常黏膜組織，以及其中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)移組織22 例。所有標本經(jīng)HE染色確定，且所有患者術(shù)前均未經(jīng)放療或者化療。

1.1.2 試劑 RKIP一抗(sc-28837, Santa Cruz, 美國)； 兔specific HRP/DAB (ABC) Detection IHC試劑盒、 DAB顯色試劑盒、 β-actin(北京中杉金橋公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫組化法檢測RKIP的表達 福爾馬林固定、石蠟包埋組織， 4 μm厚的組織切片常規(guī)失蠟、微波抗原修復(fù)20 min， 室溫下3%過氧化氫封閉30 min，PBS沖洗后用10%山羊血清封閉30 min。 RKIP一抗(sc-28837) 稀釋度： 1∶200)4 ℃冷庫孵育組織切片過夜，PBS漂洗3 次；辣根過氧化物酶孵育后通過DAB顯影液顯示著色情況，隨后使用蘇木精復(fù)染。以PBS替代一抗作為空白對照。

1.2.2 免疫組化結(jié)果評定 每張組織切片用光學(xué)顯微鏡(×400)隨機觀察5 個視野，由3 位病理科醫(yī)生分別完成并計分。RKIP的表達根據(jù)染色強度(0～3 分)和陽性細胞所占百分比來綜合評定，根據(jù)參考文獻[9]的標準進行評分。

1.2.3 Western blot(WB)法檢測RKIP蛋白表達 提取手術(shù)標本組織總蛋白，定量后與上樣緩沖液混合均勻，100 ℃沸水中煮5 min， SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝膠電泳后將其轉(zhuǎn)移到PVDF 膜，封閉液封閉1 h后加入RKIP一抗4 ℃搖床孵育過夜，TBST 洗滌3 次，每次10 min。洗滌后加入二抗常溫孵育2 h后，TBST 洗滌3 次，每次15 min。然后加入顯影液壓片，顯影，拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié)果采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析，RKIP表達與臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性分析采用用χ2檢驗。計量資料間差異分析采用單因素方差分析，P<0.05認為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 RKIP在OSCC中的表達情況

在OSCC周圍的正常組織和口腔黏膜白斑中，RKIP幾乎存在于上皮全層，主要表達在細胞質(zhì)。在OSCC組織切片中，RKIP主要表達也在細胞質(zhì)。 50 例原發(fā)性口腔癌組織切片中21 例(42.0%)高表達；而相應(yīng)的50 例癌旁正常組織中36 例RKIP(72%)高表達，口腔黏膜白斑組30 例中有20 例(66.7%)RKIP高表達。癌旁正常組織組與口腔白斑組的RKIP表達沒有顯著性差異，然而，OSCC組相比這兩組RKIP的表達有明顯的下降。

2.2 RKIP在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的表達

在22 例發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)的病例中7 例(28%)檢測到RKIP的表達，在28 例沒有發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)的病例中17 例(60.7%)檢測到RKIP的表達，表明RKIP在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中表達減少甚至消失；同時， 3 例發(fā)生淋巴結(jié)遠處轉(zhuǎn)移的組織切片中幾乎檢測不到RKIP的表達。

2.3 WB法檢測RKIP的表達

RKIP在OSCC組、正常組織組、口腔白斑組、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組都有表達(圖 2)。 RKIP蛋白在正常組和白斑組的表達量明顯高于OSCC組和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。RKIP在OSCC組、 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組、 正常組織組、 口腔白斑組、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的蛋白表達量分別為: 0.463±0.010 0、 0.352±0.009、 0.824±0.021、 0.752±0.015； 前2 組與后2 組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖 1 RKIP在癌旁組織、口腔白斑、 OSCC、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織中的表達情況

(×400)

Fig 1 RKIP expression of normal oral mucosa, oral leukoplakia, OSCC and lymph node with metastases of OSCC

(×400)

表 1 RKIP在不同口腔組織中的表達

表 2 RKIP表達與OSCC患者臨床特征之間的相關(guān)性

Tab 2 Association between RKIP expression and clinicopathological features in patients with OSCC

臨床指標RKIP表達(%)n高 低高表達率(%)P值性別 男 28 11 17 39.20.163 女 22 10 9 45.4年齡 >55 24 9 15 37.50.543 <55 26 12 13 46.1原發(fā)部位 舌 2116 5 76.20.801 頰 129 3 75 硬腭 11 8 3 72.7 牙齦 65 1 83.3病理分化 高 2712 15 44.40.432 低/中 2311 12 47.8T分期 1-2 3817 21 44.70.253 3-4 124 7 33.3N分期 N0 3519 16 54.20.023 N+ 154 11 26.6TNM Ⅰ～Ⅱ 2715 12 55.50.017 Ⅲ～Ⅳ 237 16 30.4

圖 2 蛋白質(zhì)印跡法(WB)檢測RKIP在不同組織中的表達情況

3 討 論

RKIP是負調(diào)控Ras-Raf-Mark-Erk細胞增殖信號傳導(dǎo)通路的蛋白之一，通過與Raf-1激酶的結(jié)合，RKIP能夠抑制細胞的過度增殖，維持細胞數(shù)量的動態(tài)平衡[10]。研究表明，RKIP能夠抑制多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及轉(zhuǎn)移[11-12]。RKIP抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的機制目前尚不清楚，可能RKIP的過表達同樣會抑制轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因。Al-Mulla等[13]發(fā)現(xiàn), RKIP在頭頸部正常組織中表達較高，本實驗通過免疫組化法和蛋白質(zhì)印跡法發(fā)現(xiàn)RKIP在口腔正常組織和口腔癌前病變組織(口腔白斑)中高表達，與他們研究結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)，RKIP在口腔鱗狀細胞癌中的表達顯著減少；在癌癥患者相應(yīng)的轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中，RKIP的減少更加明顯；在遠處轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)中，甚至沒有RKIP的表達。RKIP表達的喪失與OSCC的遠處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及臨床分期相關(guān)，但是與腫瘤的原發(fā)部位和組織學(xué)分級無關(guān)，這與Fu 等[11]發(fā)現(xiàn)RKIP表達對前列腺癌的組織學(xué)分級無關(guān)相一致，表明RKIP可以影響OSCC的發(fā)展和轉(zhuǎn)移，但是對OSCC的腫瘤性質(zhì)沒有影響。RKIP可能是一種口腔鱗狀細胞癌的轉(zhuǎn)移抑制劑。

本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)在OSCC中RKIP的表達喪失與癌細胞遠處轉(zhuǎn)移之間存在著顯著的相關(guān)性，在發(fā)生遠處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織中RKIP的表達明顯低于沒有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的原發(fā)性癌組織，甚至沒有RKIP的表達。OSCC的遠處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移預(yù)示著預(yù)后不良、生存時間縮短的臨床結(jié)局。以往的研究表明，RKIP表達喪失在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中預(yù)示著腫瘤高度惡性和預(yù)后生存期較短[14]，RKIP表達下降在鼻咽癌中往往預(yù)示著癌細胞發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[15], 磷酸化的RKIP能夠作為肺癌的一種預(yù)后因子[4]。所以，低表達的RKIP可能作為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的OSCC患者預(yù)后不良的臨床參考指標之一。

以往的研究發(fā)現(xiàn)RKIP在多種腫瘤中發(fā)揮著抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的功能，RKIP較少或缺失與腫瘤的侵襲性相關(guān)。本研究也發(fā)現(xiàn)RKIP的表達缺失與OSCC的的發(fā)展和轉(zhuǎn)移顯著相關(guān),RKIP可能是通過抑制OSCC腫瘤新生血管的生成及抑制腫瘤的血管內(nèi)侵襲來發(fā)揮其抑制腫瘤生長和侵襲的；也可能是對OSCC侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)基因進行調(diào)節(jié)，抑制相關(guān)的腫瘤轉(zhuǎn)移信號通路。但RKIP抑制OSCC轉(zhuǎn)移的具體機制尚不明確，還需要更進一步的研究來探索。