鹿茸補骨片對增加骨密度功能的試驗研究

王 丹，孫敬蒙

（1.長春中醫藥大學藥學院，長春 130117；2.吉林大學白求恩第一醫院藥學部，長春 130021）

隨著我國人口老齡化程度的加劇，骨質疏松癥發病率也隨之升高[1-2]，其最大的危害是骨質疏松性骨折，且前臂遠端骨折一直被認為是典型的骨質疏松性骨折[3-5]。骨密度作為骨質疏松癥的預測指標[6-8]，其保健食品的開發引起了醫藥工作者的高度關注，鹿茸補骨片主要采用吉林省道地藥材馬鹿茸與黃芪配伍為君藥[9]，《本草綱目》記載[10]，鹿茸能夠起到養血益陽，強筋健骨，治一切虛損、耳聾、目暗、眩暈虛痢作用[11-12]。為進一步證實鹿茸補骨片增加骨密度的功能，本研究綜合分析了其對骨密度及骨鈣含量等指標的影響，并對鹿茸補骨片進行急性經口毒性試驗，初步對原料毒性特性進行評估，本文研究內容可為鹿茸補骨片保健食品的研發及增加骨密度機理研究提供實驗基礎和理論依據。

1 材料

1.1 試驗動物與條件 SPF 級SD 大鼠和SPF 級ICR小鼠購自遼寧長生生物技術有限公司，實驗動物許可證號：SCXK（遼）2015-0001，在SPF級動物實驗中心（屏障環境）飼養（許可證號：SYXK（黑）2011007），溫度為21 ～23 ℃，濕度為55%～58%。試驗動物所用的清潔級飼料購自北京科澳協力飼料有限公司（許可證號：SCXK(京)2014-0010）。

1.2 樣品 鹿茸補骨片，由哈爾濱久盛醫藥科技開發有限公司，以馬鹿茸、黃芪、骨碎補、熟地黃為原料，樣品為異形片劑，0.53 g/片（約每片含生藥馬鹿茸0.24 g，黃芪0.78 g，骨碎補0.52 g，熟地黃0.78 g），推薦成人（60 kg 計）用量為2 片/次，2 次/d。

1.3 儀器與試劑 雙能X 線骨密度儀（上海伊沐醫療器械有限公司）、原子吸收分光光度計（北京達豐瑞儀器儀表有限公司）、電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）、精密卡尺（東莞市三本精密儀器源頭廠）、動物解剖器械、灌胃針、注射器等均購自吉林省金泰化玻有限公司；主要試劑如硝酸、高氯酸為優級純，氧化鑭、碳酸鈣及鹽酸等均為分析純由吉林省金泰化玻有限公司公司。

1.4 劑量設計 樣品推薦用量為2 次/d，2 片/次，0.53 g/片，因此每人2.12 g/d。成人體質量以60 kg 計，則樣品用量相當于0.035 g/ kg·bw。以人體推薦量的5 倍，即每日0.175 g/kg·bw 為低劑量，另設2 個劑量組：0.35 g/kg·bw （人體推薦量的10 倍為中劑量）和1.05 g/kg·bw （人體推薦量的30 倍為高劑量）。同時設空白對照組（灌胃去離子水），以及假手術+去離子水組和卵巢切除+去離子水組。

2 功能性試驗

2.1 試驗方案 雌性SD 大鼠50 只，適應性飼養5 d后隨機分成5組，每組10 只。去勢手術安排：假手術+去離子水組，鼠經腹腔注射30 mg/kg·bw 的戊巴比妥鈉溶液麻醉，在嚴格無菌操作下，腹位固定后于腹中線距陰道口3 ～4 cm 處去毛，分別用碘酒和酒精消毒，待稍干后切開皮膚和腹肌約2 ～3 cm，腹肌和皮膚分層縫合后，再次消毒。最后經后肢肌肉注射2 萬U 青霉素；卵巢切除組+去離子水組和雷允上牌固葆片三個劑量組，麻醉方法同上，在嚴格無菌操作下，腹位固定后于腹中線距陰道口3 ～4 cm 處去毛，分別用碘酒和酒精消毒，待稍干后切開皮膚和腹肌約2 ～3 cm，切口視野可見白色脂肪，撥開脂肪層找到子宮后，輕輕將一側子宮角拉出，在其末端可見被脂肪團包裹的卵巢。分離脂肪團，便可見粉紅色或黃紅色的卵巢，以止血鉗夾住卵巢，然后將卵巢下輸卵管（包括脂肪）用絲線結扎，剪除卵巢（檢查是否完全剪除），順勢將子宮角送回腹腔中，同法剪除另側卵巢，腹肌和皮膚分層縫合后，再次消毒。最后經后肢肌肉注射2 萬U青霉素。為保證手術成功，大鼠摘除卵巢后5 d，進行陰道涂片檢查（用滴管吸取少量生理鹽水，輕輕插入陰道1 ～2 cm，沖洗數次后吸出，涂于玻片上，鏡下觀察），1 次/d，連續7 d，以檢查大鼠卵巢是否完全摘除；如涂片呈動情反應（鏡下見大量半透明、扁平的表皮細胞），表明動物卵巢切除不完全，應棄去不用[13-14]。

切除大鼠雙側卵巢7 d 后，按照1.4 劑量設計，卵巢切除三個劑量組（灌胃液的配制：分別取鹿茸補骨片1.75 g，3.5 g，10.5 g，加去離子水定容至100 mL，配制成0.175 g/kg·bw，0.35 g/kg·bw，1.05 g/kg·bw的灌胃液）；經口給予假手術+去離子水組和卵巢切除+去離子水組動物等容積的去離子水。所有動物灌胃劑量均為10 mL/kg·bw，1 次/d，連續灌胃90 d，每周稱體質量并按體質量調整灌胃量。

2.2 骨密度測定 將待測股骨放置測量臺上，與骨密度儀探測頭移動方向垂直，移動待測股骨，令其待測點標記線與探測頭移動軌跡與測量臺上的垂直投影重合。開始測量，每個點測量2 次，2 次測量誤差不大于10%。將2 次結果取平均值[15-16]。

2.3 骨鈣含量測定 取大鼠一側股骨，在105 ℃烘箱中烘干至恒重后，精密稱重和精密測量長度，記錄數值。將股骨研成粉末，精密稱取適量（0.300 ～1.000 g），置于150 mL 三角瓶中，上蓋小漏斗，加入混酸（硝酸：高氯酸= 4：1）15 ～20 mL，在電熱板上加熱消化直至冒白煙并透明無色。消化液透明無色后加入少量去離子水，煮沸，除去剩余的酸，重復2 次，最后消化液體積不超過1 mL?？瞻讓φ諡橄嗤w積的混酸，按照樣品處理相同方法消化制得。以原子吸收法測定骨鈣含量[17]。

2.4 數據處理 采用SPSS 軟件進行數據分析。先進行方差齊性檢驗，方差齊，計算F值，F＜F0.05，結論：各組均數間差異無顯著性；F≥F0.05，P≤0.05，用多個實驗組和一個對照組間均數的兩兩比較方法進行統計；對非正態或是方差不齊的數據進行適當的變量轉換，待滿足正態或是方差齊要求后，用轉換后的數據進行統計；若是變量轉換后仍未到達正態或是方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統計。

2.5 結果判定 本產品屬不含鈣的產品，卵巢切除+去離子水組（模型對照組）骨鈣含量或骨密度顯著低于假手術組（空白對照組），表明造成大鼠骨密度低下模型；卵巢切除+受試物組的骨鈣含量和骨密度較卵巢切除+去離子水組顯著增加，而其他指標（體質量除外）不顯著低于卵巢切除+去離子水組，可判定受試物具有增加骨密度功能作用。

3 急性經口毒性試驗

選用SD 大鼠和ICR 小鼠各20 只，雌雄各半，體質量分別為180 ～220 g 和18 ～22 g。大、小鼠購買后在本實驗室適應環境5 d，采用最大耐受量試驗方法，禁食16 h后24 h內經口灌胃二次[18]。取鹿茸補骨片50 g，溶于去離子水中并定容至100 mL 大、小鼠的灌胃容積均為20 mL/kg·bw，灌胃劑量均為20.0 g/kg·bw（相當于推薦劑量的666.7 倍）。觀察大、小鼠的中毒表現和死亡時間，觀察時間為14 d。

4 結果

4.1 受試樣品對大鼠體質量的影響 由表1可見，初始體質量、給樣前（去勢手術后）各組體質量無顯著性差異（P＞0.05）；實驗從第1 周開始卵巢切除+去離子水組體質量顯著高于假手術+去離子水組（第1 周P＜0.05，第2 周以后P＜0.01），90 d喂養中給予受試物各劑量組體質量顯著高于假手術+去離子水組（P＜0.01），而與卵巢切除+去離子水組無顯著性差異（P＞0.05）。

表1 受試樣品對大鼠體質量的影響（n = 10） g

4.2 鹿茸補骨片對骨鈣含量的影響 由表2可見，給予受試物90 d 后，卵巢切除+去離子水組骨鈣含量和總鈣量顯著低于假手術+去離子水組（P＜0.01），各組與卵巢切除+去離子水組相比，股骨重量略低，但沒有顯著性差異（P＞0.05），造模成功；受試物組骨鈣含量和總鈣量有不同程度增高，其中，中、高劑量組（即卵巢切除+ 0.35組和卵巢切除+1.05組）骨鈣含量和總鈣量均顯著高于卵巢切除+去離子水組（P＜0.01）。

表2 去卵巢大鼠股骨重量和骨鈣含量變化（n = 10）

4.3 鹿茸補骨片對大鼠骨密度的影響 由表3可見，給予受試物90 d 后，卵巢切除+去離子水組骨密度顯著低于假手術+去離子水組（P＜0.01），中、高劑量組股骨中心骨密度和股骨遠心端骨密度均顯著高于卵巢切除+去離子水組（P＜0.01）。

4.4 急性經口毒性試驗結果 見表4、5、6。

5 討論

鹿茸補骨片由四味中藥配伍，相得益彰，共奏補血填精，固腎健骨之功效[19-20]，適用于骨痿（骨質疏松）以五臟虛衰，腎枯髓竭證，以周身骨痛，腰背酸軟疼痛，常易抽筋、多汗，下肢痿軟無力，不能持重為主要臨床表現者[21-22]。綜合試驗結果分析可知，給予鹿茸補骨片90 d 后，中、高劑量組均能顯著提高去卵巢大鼠骨密度，低、中、高劑量組均能顯著提高去卵巢大鼠骨鈣含量，其他指標如體質量、股骨長度、股骨重量等均不顯著低于模型組。根據《保健食品檢驗與評價技術規范》2003年版判定標準，判定鹿茸補骨片具有增加骨密度功能作用。在14 d的觀察期間內，兩性別大、小鼠一般狀態良好，未出現任何中毒癥狀，無動物死亡。根據試驗所設計的劑量，觀察到的結果及大、小鼠急性毒性判定標準，可以認為鹿茸補骨片大、小鼠經口最大耐受量大于20.0 g/kg·bw，且屬無毒級，也可作為其他毒理學試驗劑量的依據。

表3 受試樣品對大鼠股骨長度和骨密度的影響（± s，n = 10） g/cm2

表3 受試樣品對大鼠股骨長度和骨密度的影響（± s，n = 10） g/cm2

注：與假手術+去離子水組比較，## P ＜0.01；與卵巢切除+去離子水組比較，△△P ＜0.01

股骨遠心端骨密度（g/cm2）假手術+去離子水 0.210±0.012△△ 0.254±0.030△△卵巢切除+去離子水 0.189±0.020## 0.200±0.018##卵巢切除+ 0.175 g/kg·bw 0.203±0.012 0.214±0.020##卵巢切除+ 0.35 g/kg·bw 0.209±0.016△△ 0.218±0.019##△△卵巢切除+ 1.05 g/kg·bw 0.215±0.018** 0.226±0.029##**組 別 股骨中心骨密度（g/cm2）

表4 鹿茸補骨片大、小鼠急性經口毒性試驗體質量（± s ，n = 10） g

表4 鹿茸補骨片大、小鼠急性經口毒性試驗體質量（± s ，n = 10） g

動物 性別 劑量/（g/kg·bw） 初始體質量 1 周末體質量 2 周末體質量小鼠 雄 20.0 20.3±1.4 25.8±1.4 30.3±2.6雌20.0 images/BZ_125_794_1287_798_1287.png 20.2±1.3 25.0±1.5 29.0±1.4大鼠 雄 20.0 201.4±11.2 241.4±7.7 293.0±8.8雌20.0 199.8±14.1 235.1±6.0 280.5±8.8

表5 鹿茸補骨片大鼠急性經口毒性試驗結果（n = 10） g/kg·bw

表6 鹿茸補骨片小鼠急性經口毒性試驗結果（n = 10） g/kg·bw