基于GC-MS分析兩地白色藜麥種子的代謝差異

時羽杰，李興龍，唐 媛，余海萍，鄔曉勇，*

(1.成都大學 農業農村部雜糧加工重點實驗室，四川 成都 610106； 2.成都大學 藥學與生物工程學院，四川 成都 610106)

代謝組學(metabolomics)是繼基因組學、蛋白組學之后又一門新興的組學，是系統生物學的重要組成部分，是對存在于生物體細胞、組織和生物流體中的非常小的分子(分子量<1 500)的代謝物進行系統的研究[1]。它主要包括靶向代謝組和非靶向代謝組[2]。靶向代謝組主要對單個或少量目標代謝物檢測，但可檢測的通量較低，需要使用大量標準品鑒定；而非靶向代謝組學是在有限的相關研究和背景知識的基礎上，對整個代謝組進行系統、全面的分析，獲取大量代謝物的數據，并對其進行處理，從而找出差異代謝物的一種研究方法[3-4]。代謝組學已在植物耐受脅迫方面被廣泛應用，植物在受到環境脅迫和與不同生物及非生物的相互作用中會產生許多次生代謝產物，以保持植物在生境中良好的適應性，所以可通過研究植物的差異代謝物質的顯著性變化來闡述其抗逆性[5]。

藜麥(Chenopodiumquinoa)是一種一年生莧科藜屬雙子葉植物[6]，起源于南美洲安第斯山脈，因其有很高的營養價值，被稱為“糧食之母”，在當地距今已有7 000多年的種植歷史[7]。藜麥是適宜人類食用的營養食品，含有蛋白質、礦物質、氨基酸、纖維素、維生素等營養成分，含量明顯高于大多數常見谷物[8]。美國國家航空航天局(NASA)將其列為人類未來移民外太空的理想“太空糧食”[9]。聯合國糧農組織(FAO)認為藜麥是唯一一種可滿足人體基本營養需求的單體的糧食作物，并正式推薦藜麥為最適宜人類的“全營養食品”[10]，還將2013年定為國際藜麥年，以促進藜麥在全世界的推廣和發展[11]。藜麥種子有多種顏色，營養品質差異較大[12]。來源于不同產地的同種藜麥在營養品質上存在明顯的差異[13]。Park等[14]通過測定不同產地的藜麥種子發現美國產的藜麥種子的總多酚含量明顯高于秘魯與韓國。曹亞楠等[15]利用UPLC結合統計分析的方法研究四川、云南、甘肅、內蒙古和國外等多個產地的藜麥種子的營養成分發現，由于環境和土壤性質等原因，營養組分有很大差異。郭敏等[16]通過利用GC-MS研究云南、青海、秘魯三地的藜麥種子，發現不同產地藜麥的脂肪酸組成相似，但含量差異顯著，還有葡萄糖、麥芽糖等小分子物質差異也很顯著。Reguera等[17]研究不同產地對藜麥營養成分的影響，發現不同的生境對藜麥營養成分影響較大。由于藜麥含有大量的多酚和黃酮物質，使得藜麥有較強的抗氧化能力，可以快速地通過自身的調節清除氧自由基，保護植物組織和細胞抵御非生物脅迫，賦予藜麥較強的抗逆性。不同的產地導致藜麥的抗氧化物質活性也有很大的差異。趙亞東[18]通過測定西寧和烏蘭兩地的藜麥發現，營養物質存在顯著差異，西寧藜麥賴氨酸、粗纖維、脂肪、蛋白、淀粉等含量均高于烏蘭藜麥，而烏蘭藜麥的黃酮、多酚、皂苷等功能性物質的含量均高于西寧藜麥，所以烏蘭藜麥有更強的清除氧自由基的能力，有更強的抗逆性。Hirose等[19]通過研究不同產地日本和南美的藜麥的抗氧化特性及黃酮類成分，發現日本藜麥的黃酮類成分高于南美藜麥，有較好的抗氧化活性，能更好地抵御非生物的脅迫。由于藜麥的高營養價值以及較強的抗逆性，能在土壤貧瘠的高寒地區種植，所以國內研究人員對其營養成分、抗氧化活性物質等研究較為深入。但利用GC-MS技術對不同產地藜麥的代謝物質進行分析，從差異代謝物以及代謝途徑對不同產地的藜麥進行研究的報道甚少。所以本實驗以非靶向代謝組學來探究四川和青海兩地的白色藜麥種子，以獲取全面的差異代謝物和相關代謝通路的信息，來揭示兩地不同生境下白色藜麥種子的代謝差異，為今后研究揭示藜麥在不同栽培地區造成的差異提供理論依據，以期更好地指導藜麥在四川和青海兩地的種植。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實驗材料與試劑

白色藜麥種子由成都大學農業農村部雜糧加工重點實驗室提供，于2018年5月分別在四川省涼山州的鹽源縣和青海海西州都蘭縣種植，于2018年9月分別在兩地收獲藜麥種子，經發芽試驗篩選，取發芽勢和發芽率相似的種子，用篩選后的種子作為樣本材料。

N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺內含1%三甲基氯硅烷(GC derivatization，≥98.5%)、甲氧氨基鹽酸鹽、核糖醇標準品均購自Sigma公司。吡啶、甲醇、氯仿均為色譜純(成都科隆化學品有限公司)。

1.1.2 實驗儀器

Agilent GC-MS 7890B 5977氣質聯用儀(美國)、DB-5MS(30 m×0.25 mm，0.25 μm)毛細管氣相色譜柱(安捷倫，美國)、THZ-82水浴恒溫振蕩器(常州榮華儀器制造有限公司)、通風櫥、臺式高速冷凍離心機H1850R(湘儀，湖南)、ZLS-2真空離心濃縮儀(赫西儀器有限公司，湖南)。

1.2 實驗方法

代謝組樣品制備參考薛水玉等[20]的方法，將藜麥種子加入液氮快速研磨，稱取100 mg于EP管中，每個樣品做6個重復樣。均加入甲醇∶水∶氯仿體積比為2∶2∶1的溶液進行提取，于各管中移取300 μL上清液至一個干凈的EP管中將有機溶劑完全揮干，再進行衍生化處理[21]，將處理后的樣品轉移置進樣瓶內襯管中于GC-MS中進行檢測。

質控樣品QC制備：等量移取每個樣品的上清液混勻至300 μL于EP管中，做6個重復樣本，與樣品進行一樣的處理后平均分配插入樣品中上GC-MS進行檢測，可以用于驗證儀器和方法的穩定性和準確性。

1.3 GC-MS分析條件

色譜柱為DB-5MS(30 m×0.25 mm，0.25 μm)毛細管氣相色譜柱。升溫程序為起始溫度保持在80 ℃，2 min后以10 ℃·min-1升至190 ℃，再以3 ℃·min-1升至220 ℃，最后以20 ℃·min-1升至280 ℃，保持10 min；載氣為氦氣(99.999%)；恒流，流速為1 mL·min-1；進樣模式為不分流進樣，進樣量1 μL。

電子碰撞內能為70 eV；離子源溫度為220 ℃；傳輸線溫度為270 ℃；注射劑溫度為280 ℃；掃描速度為每20 s光譜全波段掃描法捕獲；溶劑延遲：420 s；質量掃描范圍m/z為70—500。

1.4 數據處理

用GC-MS光譜全波段掃描法分析藜麥種子的代謝物質。將原始數據上傳至XCMS 平臺進行預處理包括行峰識別、峰過濾、峰對齊等[22]，同時設置相應參數[23]。最后得到包括質核比(m/z)和保留時間(rt)及峰面積(intensity)等信息的數據矩陣；導出數據至Excel進行后續整理，用SIMCA-P軟件作主成分分析，然后利用正交-偏最小二乘判別分析，篩選差異代謝物，再利用Mev進行聚類熱圖分析，最后利用MetaboAnalyst平臺進行代謝通路的分析。

2 結果與分析

2.1 主成分分析

用XCMS對原始數據進行峰識別、過濾、對齊等處理后，先將數據導出至Excel中進行面積歸一化處理，把處理后的數據導入SIMCA-P軟件中進行主成分分析(PCA)，用UV算法處理數據進行擬合，擬合后方程的R2X=0.781>0.5說明擬合性較好，得到PCA的得分圖(圖1)。由圖1可以觀察到質控樣品QC較為密集，說明方法和儀器穩定可靠，模型可以用于數據的分析。且所有樣品除了點E2，其余的點都處在95%的置信區間內。組內樣品都較為聚集，說明樣品的重復性很好，且較為穩定；組間的樣品E-F較為分散，說明E和F間存在著差異。用DModX進行初步篩選剔除異常點E2，以便后續分析的準確性。

E，青海都蘭縣的藜麥樣本；F，四川鹽源縣的藜麥樣本。下同。E， The samples from Dulan County， Qinghai Province; F， The samples from Yanyuan County， Sichuan Province. The same as below.圖1 PCA總得分圖Fig.1 PCA total score

2.2 正交-偏最小二乘判別分析

2.2.1 OPLS-DA分析模型的建立及驗證

為了篩選出組間的差異代謝物，要通過監督分析模式，正交-偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)過濾掉與分類無關的信息以更為準確地分析組間差異[24]。首先把青海都蘭和四川鹽源的白色藜麥種子進行分組，用Par算法處理數據后，用OPLS-DA模型進行擬合，得到OPLS-DA得分圖(圖2-a)。由得分圖可知，E-F組明顯分開，說明組間差異大；組內點相對較為聚集，說明樣品內的重復性好且較為穩定。再經過OPLS-DA置換檢驗來驗證模型是否過擬合，得到檢驗圖(圖2-b)。圖中所有藍色的Q2點從左到右均低于最右邊的原始的藍色的Q2點，且Q2<0，R2和Q2的回歸線與橫坐標交叉或者小于0，說明評估模型可靠有效[25]。可以用OPLS-DA模型來進行數據的分析。

2.2.2 差異代謝物篩選

根據OPLS-DA分析得到S-plot圖(圖3-a)和變量投影重要性(VIP)圖(圖3-b)來篩選差異代謝物質。S-plot圖中所有的代謝物質呈現“S”型分布，其中越靠近“S”型的末尾兩端，貢獻越大，差異越顯著[27]；VIP圖中柱子越高，VIP值越大，貢獻越大，差異越顯著。再通過SPSS 22.0軟件對篩選出的差異代謝物進行t檢驗，當P<0.05時表明差異顯著，被認為有統計學意義。最后通過綜合分析(VIP>1，P-value<0.05)來篩選出差異標志代謝物[26]，總共篩選出顯著差異代謝29個。再用SPSS 22.0進行變化差異倍數分析(fold change，FC)得到FC值，把FC值進行log以2為底的數據轉換，讓差異特別大的和差異比較小的數值縮小之間的差距，突顯差異代謝物的表達，一般來說，log2FC>0，說明表達為上調；log2FC<0，說明表達為下調。本實驗的數據處理后結果如表2，經過篩選總共檢測到差異代謝物質29個，主要是15個氨基酸(甘氨酸、L-纈氨酸、L-谷氨酸、谷胱甘肽、GABA等)，6個有機酸(5-磺基水楊酸、乳清酸、肉桂酸等)，還有一些糖醇、胺類、多酚和生物堿。其中有22個差異代謝物質的log2FC>0，為表達上調，主要包括12個氨基酸，5個有機酸和一些糖醇、多酚和生物堿；7個差異代謝物質的log2FC<0，為表達下調，主要包括5-磺基水楊酸、N，N-二甲基甲酰胺、β-丙氨酰-賴氨酸、L-谷氨酸、表沒食子兒茶素、3-甲基氧基苯二甲酸酯、異丁胺。所以基本上所有的氨基酸和有機酸的含量都顯著增加，氨基酸和有機酸是重要的滲透調節物質，與植物的抗逆性密切相關。

2.3 聚類熱圖分析

圖2 OPLS-DA得分圖(a)和檢驗圖(b)Fig.2 OPLS-DA score plot (a) and permutation test graph (b)

圖3 OPLS-DA的S-plot圖(a)和變量投影重要性圖(b)Fig.3 S-plot graph (a) and VIP graph (b) of OPLS-DA

表1E-F中篩選的差異代謝物

Table1Differential metabolites screened in E-F

IDMZ名稱NameVIPP-valueFold changelog2FC下調Down/上調Up873.1(R)-(-)-1-氨基-2-丙醇3.280050.0070671581.966375660.975538963上調Up(R)-(-)-1-Amino-2-propanol17147.1O-乙酰基-L-絲氨酸2.272110.0061835882.0512916191.036532605上調UpO-Acetyl-L-serine21217.1β-丙氨酰-賴氨酸1.764510.0047878060.235175608-2.088189662下調Downβ-Alanyl-lysine3273.1異丁胺Isobutylamine1.422890.0388288070.484926256-1.044162727下調Down34156.1乳清酸Orotic acid 1.818090.0009785412.0875074221.061781327上調Up3673.1正丁胺Butylamine3.883316.72593E-0922.325984184.480651869上調Up4173.1N,N-二甲基甲酰胺2.336140.0095406540.218490408-2.194358152下調DownN,N-Dimethylformamide51103.14-氨基丁酸 GABA 1.384070.0068907981.9987981470.999132786上調Up52147.1β-谷氨酸β-Glutamic acid3.208251.0285E-0822.273192544.477236458上調Up69319.2α-酮戊二酸α-Ketoglutaric acid1.039920.006559112.4457156481.290256678上調Up71147.1L-谷氨酸L-Glutamic acid 1.016630.0083554920.311030348-1.684872739下調Down77217.1乙酰丙酸Levulinic acid 1.417330.0005523752.5690306511.361224103上調Up8273.1甲胍Methylguanidine3.012155.97259E-1012.64417873.660401425上調Up8375.1甘氨酸Glycine 1.172480.0067092811.8398053820.879553163上調Up86117.1L-纈氨酸L-Valine 1.018460.010585722.0324192411.023198027上調Up91217.1乙氧基喹啉Ethoxyquin2.868865.21885E-1014.384779623.846471214上調Up93305.2L-脯氨酰胺L-Prolinamide 2.838485.11675E-1015.278887383.933467584上調Up98307.2L-谷胱甘肽(還原型)1.176460.0002377092.731499441.449693127上調UpL-Glutathione (reduced form)100217.15-磺基水楊酸5-Sulfosalicylic acid1.485830.0088839330.19587619-2.351986054下調Down121147.1DL-蘇-β-甲基天冬氨酸2.416926.70949E-1013.426351853.74699545上調UpDL-threo-β-Methylaspartic acid129233.1肌氨酸Sarcosine1.915758.885E-0932.97822975.043442051上調Up132147.13-甲基羥基吲哚1.480960.0242393250.468213822-1.09476057下調Down3-Methyloxyindole145245.1L-亮氨酰甘氨酰甘氨酸1.191253.68854E-074.4708118592.160536835上調Up L-Leucyl-glycyl-glycine146318.2楊梅素Myricetin 2.096955.56989E-1015.632052273.966435292上調Up149306.2表沒食子兒茶素(-)-Epigallo catechin 1.055580.0336664180.409015413-1.289772886下調Down152191.15-羥吲哚乙酸2.040886.87552E-1014.877383293.895048895上調Up5-Hydroxyindoleacetic acid 196245.1高絲氨酸內酯Homoserine lactone1.215070.00078214927.110260034.760767046上調Up228306.23-碘-L-酪氨酸3-Iodo-L-tyrosine1.54395.54309E-1016.046585784.004194464上調Up235148.1肉桂酸trans-Cinnamic acid 1.280141.04534E-0826.016176584.70133705上調Up

將E-F中篩選出的差異代謝物質進行聚類熱圖分析，得到聚類熱圖(圖4)。圖中每一個縱列表示一組樣本，每個像素點表示一個代謝物。每個像素點的顏色從綠色到紅色過渡，其中顏色表示物質的表達程度，紅色為高表達代謝物，綠色為低表達代謝物。進行層次聚類分析，圖中顯示E1、E3、E4、E5、E6、E2的E組所有樣品都聚集在同一簇中，F3、F4、F5、F1、F2、F6的F組的所有樣品都聚集在同一簇中，而且E組和F組明顯分開，說明兩組之間存在明顯差異，也說明篩選出的顯著差異代謝物能作為標志物將兩組明顯區分開，其中有的代謝物質也被聚在一簇中，說明這些代謝物有相似的功能或參與了同一條代謝通路。

2.4 差異代謝物通路分析

把篩選出的差異代謝物質數據上傳至MetaboAnalyst平臺中進行信號通路分析，得到代謝通路影響因子圖(圖5)。識別出可能的受生物擾動的代謝通路[28]，對差異代謝物和通路進行相關性分析，總共檢測到24條相關通路，其中氣泡大小表示impact值的大小，氣泡越大說明impact值越大；氣泡的顏色深淺表示p值的大小，顏色越深表示-log(p)值越大。根據impact值和-log(p)值的綜合分析，選出impact>0.2或-log(p)較大的通路[29]，分別為谷胱甘肽代謝(glutathione metabolism)，氮代謝(nitrogen metabolism)，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝(alanine， aspartate and glutamate metabolism)，氨酰基-tRNA生物合成(aminoacyl-tRNA biosynthesis)，苯基丙氨酸代謝(phenylalanine metabolism)，硫代謝(sulfur metabolism)，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝(glycine， serine and threonine metabolism)，并在圖中標出。

圖4 差異代謝物的聚類熱圖Fig.4 Cluster heat map of differential metabolites

其中谷胱甘肽代謝通路最為顯著，p值為0.004 119 9，-log(p)為5.491 9，impact值為0.505 08。主要有3個被檢測到的差異代謝物富集于此代謝通路上，分別為甘氨酸(glycine)、谷胱甘肽(glutathione)、L-谷氨酸(L-glutamic acid)。谷胱甘肽具有抗氧化的功能，可以幫助植物清除自由基和過氧化物，維持植物體相對穩定的狀態，可提高植物的抗逆能力，對植物抵御環境因素的變動有著重要作用[30]。而四川鹽源的白色藜麥與青海都蘭的白色藜麥相比，甘氨酸和谷胱甘肽表達上調，L-谷氨酸表達下調。其余的代謝途徑有3條是氨基酸代謝途徑，還有3條分別是氮代謝、硫代謝和氨酰基-tRNA生物合成，都與蛋白質的合成密切相關。且通路中涉及的大部分氨基酸和有機酸均為上調表達，說明白色藜麥主要是通過氨基酸和有機酸含量的增加以及相關通路的調節，尤其是谷胱甘肽代謝途徑通過谷胱甘肽還原態和氧化態的循環來消除植物體內由于脅迫產生的氧自由基來保護植物組織和細胞，提高其對環境的適應性及其抗逆性。而四川鹽源的白色藜麥與青海都蘭的白色藜麥相比，大部分氨基酸和有機酸均顯著增加，說明了四川鹽源的白色藜麥有更好的抗逆性和適應性，白色藜麥更適于在四川鹽源栽培種植。

圖5 代謝通路影響因子圖Fig.5 Influence factors of metabolic pathway

3 結論與討論

利用非靶向代謝組分析對四川鹽源和青海都蘭兩地的白色藜麥種子進行分析后，總共篩選出29個顯著差異代謝物質，其中有15個氨基酸(甘氨酸、L-纈氨酸、L-谷氨酸、谷胱甘肽、GABA等)，6個有機酸(5-磺基水楊酸、乳清酸、肉桂酸等)，還有一些糖醇、胺類、多酚和生物堿。其中有22個代謝物質是表達上調，7個代謝物質是表達下調。再根據主要的差異物質進行代謝通路的富集分析，得到相關通路24條，其中有7條通路較為顯著，分別為谷胱甘肽代謝，氮代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，氨酰基-tRNA生物合成，苯基丙氨酸代謝，硫代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝。

谷胱甘肽代謝(glutathione metabolism)通路影響值最大，差異最為顯著。谷胱甘肽作為生物體內最主要的非蛋白巰基和含量最豐富的低分子量多肽，具有很強的抗氧化性，在植物抗逆中直接和間接參與許多功能活動[31]。大量研究表明，氨基酸和有機酸含量的增加能提高植物的抗逆性[32]。劉建兵[33]研究發現，干旱脅迫下馬尾松苗木的脯氨酸及游離氨基酸顯著增加，使得苗木能在干旱環境下生長。高榮嶸等[34]研究發現，花生幼苗在受到鹽脅迫后游離氨基酸的含量顯著上升，提高了幼苗的抗鹽性。包雨卓[35]采用GC-MS技術分析冬小麥在低溫脅迫下的代謝物質變化，發現大部分糖類、氨基酸和有機酸顯著增加，且隨著溫度降低而升高，說明冬小麥通過大部分糖類、氨基酸和有機酸的顯著增加來抵御低溫脅迫。本實驗對比四川鹽源和青海都蘭的白色藜麥種子的差異代謝物質變化，發現參與谷胱甘肽代謝的代謝物質甘氨酸和谷胱甘肽均顯著增加，還有大部分的氨基酸和有機酸也都顯著增加。說明四川鹽源的白色藜麥比青海都蘭的白色藜麥有更多的抗氧化活性物質和滲透調節物質，能更快地清除環境脅迫所產生的氧自由基來保護植物組織和細胞，具有更強的抗逆性和適應性，這可能與四川鹽源的地理氣候有關。鹽源縣日溫差較大，年均氣溫12.1 ℃，最高溫度30.7 ℃，最低溫度零下11.3 ℃。研究結果表明，四川鹽源的白色藜麥更適合在這條件下生長，導致植株有更強的抗逆性和適應性，結果為后期進一步研究藜麥的生態適應性以及抗逆性奠定了理論基礎。